розділ 2.1), вік яких складав 3 та 6 місяців, виконували травматичне
ушкодження в дистальному метафізі стегнової кістки. Для цього під загальним
тіопенталовим наркозом в умовах асептики тваринам, робили розріз шкіри, боковим
доступом відкривали дистальний метафіз та за допомогою зубного бору (діаметром
1,3 мм) утворювали наскрізний дефект (рис. 2.1). Рану обробляли розчином
антибіотику та пошарово ушивали.
Таблиця 2.2
Розподіл тварин по серіям експерименту
Експериментальна модель
3-х місячні тварини
6-ти місячні тварини
Контроль
Дослід
Контроль
Дослід
Травматичне ушкодження стегнової кістки на фоні глюкокортикоїд-індукованого
остеопорозу (0,5 мг/100 г живої ваги)
25
25
25
25
Травматичне ушкодження стегнової кістки на фоні глюкокортикоїд-індукованого
остеопорозу (5 мг/100 г живої ваги)
25
25
В якості контролю використовували тварин з аналогічним травматичним
ушкодженням, які отримували фізіологічний розчин.
Рис. 2.1. Наскрізний дефект дистального метафізу стегнової кістки.
Після проведення операції продовжували введення гідрокортизону та
фізіологічного розчину до виведення тварин з експерименту за термінами
дослідження (3, 7, 14, 21 та 30 діб). Протягом всього терміну експерименту
тварини знаходилися під постійним наглядом.
Евтаназію щурів здійснювали шляхом передозування ефіру згідно термінам
дослідження.
Протокол експериментів (протокол № 11 від 23.06.03 та № 35 від 05.03.07) на
тваринах було затверджено Комісією з біоетики ДУ “ІПХС ім. проф. М.І.Ситенка
АМНУ” відповідно з правилами “Європейської конвенції захисту хребетних тварин,
що використовуються у експериментальних і інших наукових цілях” [75].
2.3. Методи дослідження матеріалу
Остеометричний аналіз проводили за В.Г. Ковешніковим [14, 15] з точністю до
0,01 мм. Вимірювали за допомогою штангенциркуля найбільшу довжину стегнової
кістки, ширину проксимального метафізу, ширину дистального метафізу, ширину
середини діафізу, ширину шийки стегнової кістки (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Остеометричні показники стегнової кістки щурів.
Для гістологічного дослідження стегнові кістки тварин вилучали та звільняли від
м’яких тканин. Виділяли дистальні метафізи та діафізи стегнової кістки, а також
ділянки з дефектом і фіксували у розчині з масовою часткою нейтрального
формаліну 10 %, проводили декальцинацію у розчині з масовою часткою азотної
кислоти 4 % при температурі 18-22°С, зневоднювали у спиртах зростаючої міцності
(у 70° спирті та двічі у 96°) та у спирті з ефіром (розчин 1:1), заключали у
целоїдин.
Гістологічні зрізи виготовляли на санному мікротомі МС-2. З кожного препарату
виготовляли по 5 зрізів товщиною 10-15 мкм. Отримані зрізи забарвлювали
гематоксиліном та еозином, а також за ван Гізон [34].
Дослідження отриманих гістологічних препаратів проводили за допомогою світлових
мікроскопів “Karl Zeiss” та БИОЛАМ (ЛОМО). Для мікрофотографування
використовували цифрову камеру Canon EOS-300D.
Для топо-оптичного дослідження макромолекул матриксу новоутворених тканин
регенерату зрізи обезцелоїдинювали за допомогою ксилолу та забарвлювали
толуідиновим синім при рН 2,5 [12] для характеристики стану глікозаміногліканів
(хондроїтин-4-сульфат та хондроїтин-6-сульфат). Використання поляризованого
світла дозволяє з високою чутливістю виявити макромолекули у міжклітинній
речовині та вивчити їх ориєнтаційну упорядкованість. Застосування реактивів із
спеціальною дипольною структурою дає можливість селективно підсилювати оптичну
анізотропію певних макромолекул у міжклітинній речовині та клітинах.
Для вивчення ориєнтаційної упорядкованості колагенових структур у новоутворених
тканинах регенерату виконували спеціальну гістохімічну реакцію на колаген з
пікросиріусом червоним [64]. Високоаніонні молекули барвника, які є диполями,
приєднуються паралельно до колагену і значно збільшують позитивну рефракцію. Це
високочутлива реакція, яка дозволяє виявити навіть найтонкіші колагенові
фібрили. В якості контролю реакцій були використані зрізи оброблені
гіалуронідазою (“Sigma”). Топо-оптичні дослідження виконували на
поляризаційному мікроскопі “Polmy-A”.
Для електронномiкроскопiчного дослідження було відібрано по 2 тварини з кожної
дослідної групи у яких з контрлатеральної кінцівки виділяли ділянки тканин
розміром 1 мм3. У тварин з модельованим глюкокортикоїд-індукованим остеопорозом
отримували ділянки епіфізарного хрящу. Для дослідження репаративної регенерації
виділяли тканини, що розташовані безпосередньо у зоні кісткового дефекту та
оточуючі його тканини. Матеріал відбирали та фіксували згідно рекомендацій Б.
Уікли [34]: у розчині з масовою часткою глутаральдегiду 4 % на фосфатному
буфері, потім декальцинували у 0,1 М розчині трилона Б, який містить 4 %
глутаральдегiду, дофiксовували в розчині з масовою часткою OsO4 1 % (фіксатором
Колфілда), зневоднювали у спиртах зростаючої міцності й ацетоні та заключали у
епон-аралдит.
Напівтонкі (1-2 мкм) та ультратонкі зрізи (30-40 нм) виготовляли на
ультрамiкротомi УМПТ-3М. Напівтонкі зрізи фарбували метиленовим синім та
основним фуксином [44], а ультратонкі – контрастували за Reynolds [120]. Оцінку
матеріалу проводили під електронним мікроскопом ЕМВ-100БР.
Гістоморфометричні дослідження кісткової тканини виконували відповідно
рекомендаціям Г.Г.Автанділова [1].
Для морфометричного аналізу користувалися центральними зрізами кісток. З
кожного гістологічного зрізу виконували по 5 вимірювань.
Аналіз діаметру остеонів, діаметру каналів остеонів проводили в нижній третині
діафізу стегнової кістки. Для вимірювання застосовували окулярний гвинтовий
мікрометр МОВ-1-16Ч ГОСТ
- Київ+380960830922