РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Метод ферментативного выделения сенсорных нейронов
Эксперименты, описанные в данной работе, выполнялись на изолированных нейронах
спинальных ганглиев месячных крыс. Для получения изолированных клеток
использовалась стандартная процедура ферментативной изоляции. Животное
декапитировали под легким эфирным наркозом и выделяли грудные и поясничные
спинальные ганглии, которые помещали в охлажденный до 4°С раствор Тироде на
15-20 минут (состав растворов приведен ниже). После отмывания ганглии
переносили в покрытый силиконом пенициллиновый флакон с 2 мл подогретого до
36°С раствора Тироде с добавлением 1 мг/мл протеиназы (тип XXIII, Sigma, США) и
0,5 мг/мл коллагеназы (Sigma, США) и выдерживали при указанной температуре в
течение 37 минут, обеспечивая постоянное перемешивание раствора. После
ферментативной обработки ганглии отмывали не содержащим ферменты раствором
Тироде той же температуры в течение 20 минут. Для получения клеточной суспензии
ганглии пипетировались с помощью стеклянных оплавленных Пастеровских пипеток в
течение 5 минут в 0,5 мл раствора Тироде. Полученную суспензию разливали в
пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм (Nunc, Дания) и выдерживали в
термостате при 36°С в течение 1 часа для прикрепления клеток ко дну чашек.
Клетки использовались в эксперименте в течение 6-8 часов после выделения.
Контрольные эксперименты показали, что изолированные таким методом нейроны
сохраняют свои основные характеристики в течение 24 часов.
Отбор нейронов для эксперимента проводился по двум параметрам – диаметру сомы
(18 – 40 мкм) и наличию кальциевых транзиентов в ответ на краковременную
аппликацию капсаицина в кальцийсодержащем внеклеточном растворе.
2.2. Модель стрептозотоцин-индуцированного диабета
Среди искусственных методов инициации диабета можно выделить резекцию
поджелудочной железы, вирусные воздействия, а также приложение к клеткам
цитотоксических агентов. Одним из самых распространенных методов, применяемых
для индукции диабета, является внутривенное или внутрибрюшинное введение
цитотоксического агента b-клеток – стрептозотоцина (СТЗ). В модели
экспериментального диабета мы использовали самцов крыс линии Вистар в возрасте
21 постнатального дня. Диабет вызывался одной внутрибрюшинной инъекцией
стрептозотоцина растворенного в 0,9 процентном растворе NaCl (изотонический
0,9% раствор для инъекций, Галичфарм, Львов, Украина), в количестве из расчета
80 мг на 1 кг веса животного.
Стрептозотоцин является D-глукозамидной производной N-метил-N-нитросуреи (МНУ).
Многочисленные исследования достоверно показали, что СТЗ проникает в
инсулин-производящие b-клетки островков Лангельгарца через специфический
мембранный транспортер глюкозы GLUT-2 [204]. Цитотоксический эффект
стрептозотоцина связан, по-видимому, с повреждением спирали ДНК [204], что
связано с алкилирующей активностью его МНУ части, особенно по отношению к атому
кислорода в 6-й позиции гуанина [205]. Описанное выше повреждение ДНК ведет к
сопутствующей активации поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы, что, в свою очередь,
приводит к уменьшению уровня НАД+ и истощению АТФ, которая расходуется на
восстановление ДНК. Это, в конечном итоге, приводит к прекращению выработки
инсулина и некрозу клетки [206].
Прямое действие стрептозотоцина на центральную нервную систему при его
внутривенном и внутрибрюшинном введении исключается вследствие того, что
гематоэнцефалический барьер, а также сами нервные клетки непроницаемы для
стрептозотоцина, так как в них отсутствует специфический транспортер глюкозы
GLUT-2 [204].
Характерной особенностью данной модели, отличающей ее от человеческого диабета,
является то, что животные со стрептозотоцин-индуцированным диабетом для своего
выживания не требуют постоянного введения инсулина, несмотря на развитие у них
гипо-инсулемии и гипергликемии. Для заболевших животных, характерным является
уровень глюкозы в плазме крови порядка 19-25 мМ. Подобно людям, больным
диабетом, у грызунов со стрептозотоцин-индуцированным диабетом развиваются
повреждение внутренних органов, глаз, почек, сердца, кровеносных сосудов и
нервной системы. Преимущества модели стрептозотоцин-индуцированного диабета
состоят в том, что она на сегодняшний день является наиболее подробно
описанной, а также то, что диабет может быть вызван в любом заданном возрасте.
Это может особенно быть полезно, если процедура получения клеток лимитирована
определенными возрастными рамками, а также при изучении взаимодействия диабета
и старения. Хотя модель доказала свою безусловную адекватность и полезность в
изучении эффекта хронической гипергликемии, ее невозможно поставить в строгое
эндокринологическое соответствие 1-му типу сахарного диабета, ввиду
неадекватности ее патогенезиса в сравнении с таковым у человека.
Стрептозотоцин-инъецированные и контрольные животные такого же возраста
содержались в одинаковых условиях на протяжении всего периода развития
заболевания. Часть животных бралась в эксперимент через один день после
инъекции стрептозотоцина (стрептозотоциновый контроль), исследования,
проведенные на данной группе животных, не выявили отличий в кальциевой
сигнализации по сравнению с контрольными неинъецированными животными, поэтому
данная группа не была включена в общую статистику и в дальнейшем не
рассматривалась. Остальных животных использовали в эксперименте через 5-7
недель после инъекции стрептозотоцина.
Концентрация глюкозы в плазме крови, взятой из хвостовой вены, измерялась при
помощи оптического сенсора глюко
- Киев+380960830922