РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи дослідження
2.1. Матеріали дослідження
Проведено ретроспективний аналіз архівного, поточного (біопсійний та операційний) матеріалу морфологічних досліджень патологоанатомічного відділу Інституту онкології АМН України, а також історії хвороби (комп'ютерна база даних інституту) в обсязі 227 випадків на СЮ за 1986 -1999 роки. Серед яких у 191 хворого діагноз СЮ верифікований гістологічним методом, у 31 пацієнта лікування проводилось на підставі тільки цитологічного заключення і лише у 5 хворих діагноз СЮ встановлено клініко-рентгенологічно. Отже, з 222 хворих (виключено 5 випадків, так як вони мали тільки клініко-рентгенологічний діагноз СЮ) на пухлини сімейства Юїнга, які були верифіковані гістологічним і цитологічним методом, було остаточно відібрано 70 пухлин (критерієм відбору пацієнтів була наявність не менш трьох парафінових блоків на одне дослідження), якість парафінових блоків і схоронність морфологічної будови котрих дозволяла провести імунофенотипування пухлинної тканини з панеллю моноклональних антитіл до 22 маркерів. Вік пацієнтів на СЮ складав від 1,1 до 27 років, середній - 14,5 роки, співвідношення осіб чоловічої та жіночої статі склало 1,3:1. З метою оцінки ефективності антибластомної неод'ювантної терапії, після імуногістохімічного аналізу хворих родини Юїнга остаточно верифіковано діагноз СЮ у 38 хворих, яким проведено оцінку лікувального патоморфозу, відповідно у 27 хворих після неоад'ювантної (передопераційної) ПХТ і у 11 пацієнтів після передопераційної ПХТ в поєднанні з ПТ. Групу контролю склали 15 хворих на СЮ (проведено хірургічне втручання без передопераційної анатибластомної терапії).
2.2. Методи дослідження
Морфологічне дослідження проводилось на гістологічних препаратах (гематоксилін-еозин, ван Гізон, кармін, імпрегнація сріблом) і на цитологічних препаратах (по Папенгейму). Додатково виготовлялись парафінові зрізи пухлинної тканини кісток і м'яких тканин завтовшки 4 - 5 мкм, які досліджувалися з МКАТ (маркером) з набору 22 -ох маркерів (HNK-1; S-100; NSE; HBA71; NF; PGP9.5; CAM5,2; P53; RB; RI; VIMENTIN; DESMIN; ACTIN; TRK-A; CНROMOGRANIN; MYO-D; MYOGENIN; OS-CALCIN; OS-NECTIN; C-Erb-2; BCL-2; PCNA) фірм "ДАКО" (Данія), "Coulter/Immunothech" (США) і "PharMingen", "Becton Dickinson Company" (США) із застосованням стандартного авидин - біотинового методу [19, 70, 117, 201].
Депарафінізовані та гідратовані зрізи інкубували у цитратному буфері рН 3,9-4,2 на водяній бані при 90°С. Зрізи охолоджували протягом 20 хвилин і промивали у ФБФР (фосфатний буфер на фізіологічному розчині (рН 7,2). Зрізи з первинними мишачими антитілами інкубували 60 хвилин, після чого ретельно відмивали у ФБФР 5 хвилин. На зрізи наносили біотинові вторинні кролячі антитіла на 30 хвилин, після чого їх відмивали в ФБФР протягом 5 хвилин. На зрізи наносили пероксидазу хрону, кон'юговану зі стрептавідином, на 30 хвилин. Після чого зрізи знову відмивали у ФБФР. На 10 хвилин на зрізи наносили 0,05% розчин ДАБ (3,3`-діамінобензидин) у тріс-буфері (рН=4,1), у який додавали Н2О2 (на 10 мл розчину ДАБ брали 100 мкл 3% розчину Н2О2 ) В окремих випадках в якості хромогену замість ДАБ використовували аміно-етилкарбазол (дає вишнево-червоний колір, але є нестійким). Потім зрізи відмивали у дистильованій воді, забарвлювали гематоксиліном. Зневоднювали у спиртах, просвітляли у ксилолі та заключали у бальзам.
Ядра дофарбовували гематоксиліном або метиловим зеленим. При гістологічній та імуногістохімічній верифікації враховувалися стать і вік, клініко-анатомічні особливості пухлин сімейства Юїнга за класифікацією ВОOЗ 1994 року [25, 34, 35, 37, 244], зокрема клітинні варіанти СЮ, PNET-ASKIN та інших пухлин (остеосаркоми, рабдоміосаркоми, хондросаркоми, нейробластоми та інш.), з врахуванням вторинних змін в пухлинах (некрози, крововиливи, запалення), які призводять до помилок, оскільки такі осередки з пошкоджених клітин можуть не створювати імунокон'югати, або навпаки давати їх гіпернакопичення артефактної природи. Результати імуногістохімічних досліджень оцінювали за допомогою індекса імуноекспресії (ІІЕ) .
кількість імунопозитивних клітин
ІІЕ = ---------------------------------------------------------- ? 100;
2000
Методична і технічна допомога у виконанні імуногістохімічних досліджень надана зав. кафедрою патологічної анатомії медичного факультету Валенсійського університету проф. А. Лломбартом-Бошем як другому керівнику проекту (Іспанія) "Саркома Юїнга в Європі", в якому автор приймав участь під керівництовом зав. патологоанатомічного відділу Інституту онкології АМН України проф. К.О. Галахіна як наукового керівника даної дисертації та керівника проекту з українського боку.
В 38 хворих на СЮ досліджено операційний матеріал видалених пухлин (кількісна морфометрія), які перед хірургічним втручанням отримали ПХТ або ПХТ в поєднанні з ПТ за стандартними міжнародними програмами, проведена оцінка лікувального патоморфозу пухлин за допомогою методики [11]. Хворі отримували передопераційну ПХТ або ПХТ+ПТ згідно міжнародним програмам протокольного лікування - 4 блоків ПХТ VAC або VAC + цисPt:
Блок №1
Vcr - 1,5 мг/м2 - 1д (доза).
Doxo - 60 мг/ м2 - 1д.
Cph - 1500 мг/ м2 - 2д.
Блок №2
VР-16 - 100мг/ м2 - 1,2,3д.
ЦисPt - 40мг/ м2 - 1,2,3д.
Блок №3 (варіанти)
Блоки 1 або 2
Vcr - 1,5 мг/ м2 - 1д.
Doxo - 75 мг/ м2 - 1д.
Cph - 2000мг/ м2 - 2д.
Блок №4 (варіанти)
Vcr - 1,5 мг/ м2 - 1д.
Асt-D - 500мкг/ м2 - 1,2,3д.
Ifo - 2000мг/ м2 - 1д.
Vcr - 1,5 мг/ м2 - 1д.
Doxo - 20 мг/ м2 - 1,2,3д.
Ifo - 2000мг/ м2 - 1,2,3д.
ПТ була застосована в поєднанні з неоад'ювантною хіміотерапією на апараті РОКУС-М з опроміненням зони пухлинного ураження у дробно-фракційному режимі до накопичення загальної дози опромінення 35-40 Грей.