Розділ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Під час проведення експериментальних досліджень по темі дисертації були проведені клініко-епізоотологічні обстеження 350 голів великої рогатої худоби, з них 150 голів новонароджених телят. Проведено бактеріологічні дослідження на дисбактеріоз 32-х проб фекалій новонароджених телят, взято 24 проби крові від новонароджених для проведення гематологічних, біохімічних та імунологічних досліджень. Для профілактики і корекції дисбактеріозу було виготовлено 7 серій препарату "Бактонорм". В процесі досліджень використали 50 білих мишей, 10 кролів і 5 білих щурів, 300 чашок Петрі та 600 пробірок з різними середовищами, виготовили 120 мазків, які фарбували методом Грама.
Антитіла в сироватці крові телят до ротавіруса виявляли в реакції тривалого зв'язування комплемента (РТЗК), в якості антигена в якій використовували очищену і сконцентровану суспензію ротавіруса великої рогатої худоби.
Постановку РТЗК у мікромодифікації здійснювали за загально прийнятою методикою з використанням мікротитратора "Такачі" в об'ємі 0,125см3 (по 0,025см3 кожного компонента).
Для виявлення антигену ротавіруса в фекаліях телят дослідний матеріал відбирали в стерильний посуд з прямої кишки. З матеріалу готували 20% суспензію на охолодженому розчині Хенкса, попередньо розчинивши в ньому по 103ОД/мл пеніциліну і стрептоміцину. Після триразового заморожування і розморожування суспензію фекалій струшували і центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хвилин. Надосад концентрували поліетіленгліколем і використовували для дослідження в РТЗК.
Дослідження проведені на базі науково-дослідної вірусологічної лабораторії при кафедрі мікробіології та вірусології НАУ з участю і під безпосереднім керівництвом доцента С.В. Міськевича. Дослідження по виявленню наявності антитіл в сироватці крові телят до вірусу діареї великої рогатої худоби проведені аспіранткою С.В. Бондар.
2.1. Визначення кількісного та якісного складу мікрофлори фекалій умовно здорових новонароджених телят та телят з розвинутим дисбактеріозом кишечника.
Експериментальні дослідження проводили на базі колективної спілки "Селищанське" Баришівського району Київської області. Проби фекалій від новонароджених телят відбирали в стерильні, попередньо зважені, бактеріологічні пробірки, починаючи з першої доби від народження і кожної наступної доби протягом 6-ти діб життя. Досліджуваний матеріал (без консервантів) в термосі з льодом протягом 2 годин доставляли в лабораторію кафедри мікробіології та вірусології Національного аграрного університету. Досліджуваний матеріал (проби фекалій) суспензували в ізотонічному розчині натрію хлориду (pH=7,1-7,2) у відношенні 1:10 (з розрахунку 1г фекалій і 9мл NaCl) і висівали на поживні середовища: Плоскирєва, ВСА (вісьмут-сульфіт агар) і Ендо. Наступні дослідження проводили за схемою, показаною на рис. 2.1.
Для кількісної характеристики аеробної мікрофлори проводили дозований посів на щільні середовища із трьох діагностично значимих розведень вихідного матеріалу (10-3; 10-5; 10-7). Розведення готували в п'яти бактеріологічних пробірках. В три пробірки наливали по 9,9мл ізотонічного розчину хлориду натрію ( для розведень 10-3; 10-5; 10-7), в дві пробірки 9,0мл (для розведень 10-8 і 10-9) і послідовно переносили суміш з попереднього розведення в наступне в об'ємах, які показані на рис. 2.1 (0,1мл і 1,0мл). На кожне наступне розведення брали нову стерильну піпетку і суміш добре перемішували (суспензували). Перед роботою щільні середовища підсушували в термостаті при t=37oC протягом 1 години до зникнення конденсаційної вологи.
Для виділення патогенних і умовно-патогенних ентеробактерій використовували такі середовища:
- селенітовий бульйон - рідке середовище для накопичення сальмонел;
- селективне середовище Плоскирєва для виділення шигел і сальмонел (посів робили із розведення 1:10 бактеріологічною петлею), культивували в термостаті при t=37oC протягом 18-24 годин;
- ВСА (вісмут сульфіт агар) - це виключно селективне середовище для виділення сальмонел. Посів проводили бактеріологічною петлею із розведення 1:10, розтерали шпателем і культивували в термостаті при t=37oC протягом 18-24 годин та з селенітового середовища (після термостатування 18-24 години);
- диференціально-діагностичне середовище Ендо для виділення ентеробактерій. Посів проводили петлею з розведення 1:10 піпеткою з розведення 10-5 і 10-7 в об'ємі 0,1мл з наступним розтеранням шпателем, культивуванням в термостаті при t=37oC протягом 18-24 годин;
- ЖСА (жовтково-сольовий агар) - середовище для виділення стафілококів. Посів проводили стерильною піпеткою із розведення 10-3 в об'ємі 0,1мл з наступним розтеранням шпателем і культивуванням в термостаті при t=37oC протягом 48 годин;
- середовище Сабуро для культивування грибів та дріжджів. Посів на чашку Петрі проводили піпеткою із розведення 10-3 в об'ємі 0,1 мл з наступним розтеранням шпателем, культивували в термостаті при t=24oC п'ять діб;
- середовище Сімонса - для диференціації ентеробактерій за їх властивістю використовувати цитрат натрію як єдине джерело вуглецю, тобто, для диференціації E.coli (Сім-) від інших умовно патогенних (Сім+). Посів на чашку Петрі проводили стерильною піпеткою із розведення 10-5 в
Рис. 2.1. Схема посіву фекалій на дисбактеріоз.
об'ємі 0,1мл з наступним розтеранням шпателем і культивуванням в термостаті при t=37oC протягом 24 годин;
- 5%-ий кров'яний агар для виділення гемолітичних форм мікроорганізмів (коки, ентеробактерії). Посів проводили піпеткою на чашку Петрі із розведення в 10-5 об'ємі 0,05мл з послідуючим розтеранням шпателем, культивували в термостаті при t=37oC протягом 24 годин.
Для виділення лакто- і біфідобактерій використовували середовища:
- середовище Блаурокка для культивування біфідобактерій (придонний посів робили з розведення 10-7, 10-8, 10-9 в об'ємі 1мл, культивували в термостаті при t=37oC відповідно 48-72 години;
- середовище