РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали
Робота була виконана протягом 1999 – 2003 рр. у лабораторії лептоспірозу
Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук (ІВМ УААН),
та в Центрі сучасної ветеринарної медицини м. Києва.
У дослідженнях використовували референтні діагностичні штами лептоспір,
отримані з колекції штамів лептоспір Центральної державної
лабораторії ветеринарної медицини, та з колекції штамів, отриманих з
Німеччини.
Сироватки крові тварин, що досліджували, відбирали в Центрі сучасної
ветеринарної медицини м. Києва. Всього було досліджено 2458 зразків сироваток
крові собак та 36 сироваток крові котів.
У даній роботі велике значення ми приділили гематологічним дослідженням собак
та кішок. Гематологічні дослідження проводили на біохімічному аналізаторі
“KORMAY MULTI” та гематологічному аналізаторі “MEDONIC CA 620”.
Гематологічний аналізатор “MEDONIC СА 620” з удосконаленим мікропроцесором,
який автоматично виконує підрахунок клітин, виконує повний аналіз крові.
Оператор працює з меню, з якого відбирає необхідні установки класифікації,
калібровку, очистку та інше. Використовується два зовнішніх резервуари с
реагентами, один – як ізотонічний ділюєнт, а другий – в якості фотодіод
реактиву. Коли один з зовнішніх резервуарів спустошується, про це буде вказано
на дисплеї.
“MEDONIC СА 620” має змінні установки класифікації та 9 різних програм з
обмеженням по мінімуму та максимуму для установок класифікації. Ці особливості
приладу роблять його придатним для аналізу крові тварин.
“MEDONIC СА 620” – це повністю автоматизований гематологічний аналізатор,
призначений для виміру до 20 параметрів нативної крові або попередньо
розведеної.
Визначення здійснюється при використані електронного імпедансу та безпосередньо
в отворі перетворювача. Параметри тромбоцитів, еритроцитів та лейкоцитів
вимірюються у точній аліквоті проби. Об’єм вимірюваної проби визначається
об’ємом провізійного скляного стовпчика, що називається вимірювальною трубкою.
Два оптичних датчики використовують для початку і зупинки визначення.
Об’єм крові для дослідження (відкрита пробірка) – 125 мкл. Час повного циклу –
73 секунди. Витрати реактивів на пробу:
ділюєнт – 19 мл,
лізер (попередньо розведений) – 9мл.
Біохімічний аналізатор “KORMAY MULTI”. Даний фотометр являє собою прилад для
щоденної діагностики, що базується на однопроменевому оптичному блоці з
галогенною лампою в якості джерела світла, інтерференсними фільтрами в якості
монохроматорів та кремнієвим фото - діодом в якості детектора.
Зразки зчитувалися в квадратних кюветах (ширина 10 мм). Прилад укомплектований
7-ма оригінальними фільтрами та двома вільними позиціями. Термостабілізація
здійснюється елементом Пельтьє, а температура регулюється датчиком інтегральної
мікросхеми. Програмне забезпечення управляє стабілізацією температури, зчитуючи
показання з датчика та управляючи елементом Пельтьє. Прилад контролюється за
допомогою мембранної клавіатури та “спілкується” з користувачем через 4-х
рядний, 20-ти розрядний рідкокристалічний дисплей та через 40-ти рядний
термопринтер. Прилад обладнаний каналом зв’язку RS-232-C, який разом з
програмним забезпеченням передає кінцевий результат кожного тесту і його
серійний номер. Прилад керується за допомогою меню, доступ до більшості робочих
операцій здійснюється дуже легко.
Дослідження проводили згідно настанови по застосуванню, яка додається до даного
прилада.
2.2. Методи
2.2.1. Методика дослідження сироваток крові в РМА
Виявлення антитіл до певних штамів лептоспір здійснювали за допомогою реакції
мікроаглютинації (РМА). У таблиці 2.1. наведено схему постановки даної
реакції.
Таблиця 2.1
Схема постановки РМА
№ пробірки
Кількість в см3
Розведення сироватки
Фізіологіч-ний розчин
Сироватки
До змішування з антигеном
Після змішування з антигеном
8
4,9
4,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
0,1
0,5 із розведення 1:50
2,5 із розведення 1:500
2,5 із розведення 1:1000
2,5 із розведення 1:2000
2,5 із розведення 1:4000
2,5 із розведення 1:8000
2,5 із розведення 1:16000
2,5 із розведення 1:32000
1: 50
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
1:18000
1:32000
1:64000
1:100
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
1:16000
1:32000
1:64000
1:128000
Культури, що використовували для перевірки імунних сироваток, були 7 – 14
добового віку з нагромадженням 50 – 100 рухомих лептоспір у полі зору
мікроскопа при збільшенні 150. Постановку реакції здійснювали на пластинах із
органічного скла з лунками, змішуючи 0,1 см3 сироватки із кожного розведення з
0,1 см3 кожної культури (антигену), при цьому розведення сироватки
збільшувалося вдвічі. Пластини, які містили суміш реагентів, розміщували у
термостаті та витримували протягом 1 години при 30-370С. Облік результатів
проводили під мікроскопом з конденсором темного поля при збільшенні 150 і
оцінювали в хрестах за 4-х бальною системою:
++++ аглютиновано 100% лептоспір
+++ аглютиновано 75% лептоспір
++ аглютиновано 50% лептоспір
+ аглютиновано 25% лептоспір
- аглютинація відсутня.
Виявлення лептоспір у сечі хворих собак проводили, висіваючи матеріал на
живильні середовища Кортгофа.
Накопичення 30- 40 лептоспір у полі зору мікроскопа (збільшення у 150)
спостерігали через 5 –7 тижнів після посіву.
Тому, культивовані та очищені висіви з патологічних органів були п’ятикратно
пасажовані на твердому живильному середовищі (буферно-сироватковому агарі).
Пасажі робили за допомогою бактеріологічної петлі за методом Дригальського,
попередньо розводячи культуру до поодиноких лептоспір у полі зору мі
- Київ+380960830922