РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження виконані в лабораторії лептоспірозу сільсько-господарських тварин з музеєм штамів мікроорганізмів Інституту ветеринарної медицини УААН м. Києва у період з 1999 по 2002 р.
2.1. Штами лептоспір
У дослідженнях використовували референтні діагностичні та вакцинні штами лептоспір. Діагностичні штами отримані з колекції штамів лептоспір Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини (табл.2.1). Вакцинні штами отримані з Всесоюзного науково-контрольного інституту ветеринарних препаратів ( табл. 2.2).
2.2. Живильні середовища та параметри культивування лептоспір
Для культивування лептоспір використовували живильні середовища Терських, Кортгофа з вмістом 10% сироватки крові овець або 7- 10% сироватки крові кролів. Середовища готували в лабораторних умовах за загальноприйнятою методикою [71]. Сироватку крові овець попередньо інактивували 2 години при температурі 560С, а сироватку крові кролів - 30 хв при температурі 560С. Також лептоспіри культивували на напівтвердому середовищі Флетчера (рецепт середовища отриманий з референтної лабораторії лептоспірозу, м. Амстердам,1999 р.), твердому середовищі [168], та твін-альбуміновому середовищі EMJH (Ellinghausen and McCullough, modified by Johnson and Harris). Були використані модифіковані середовища Кортгофа та EMJH [183]. рН живильних середовищ встановлювали на рівні 7,2 - 7,4, крім середовища EMJH, з рН 7,6 - 7,8.
Для проведення досліджень використовували культури лептоспір, з характерною морфологією, активною рухомістю, які не мали ознак аутоаглютинації.
Таблиця 2.1 - Діагностичні штами лептоспір та їх серогрупова відповідність
№п/пСерогрупаСероварШтам
1Javanica*javanicaVeldrat Bataviae 462Bataviae* djatzi HS 263Mini* szwajizak Szwajizak4Sejroe* polonica493 Poland 5Hebdomadis*kaburaKabura 6Tarassovi* tarassoviPerepelicyni 7Pomona* pomonaPomona 8Grippotyphosa*grippotyphosa Moskva V 9Canicola* canicolaHond Utrecht IV 10Icterohaemorrhagiae* copenhageni M 20 11Louisiana* louisiana LSU 12Shermani* shermani LT 821 13Panama* panama CZ 214 K 14Semaranga*patoc Patoc 1 15Celledoni* whitcombi Whitcomb16Australis* erinaceieuropaeiJez 1 17Autumnalis* autumnalisAkiyami A18Cynopteri*cynopteriVleermuis 3868 19Pyrogenes*pyrogenesSalinem20Ballum* ballum Mus 127 *- діагностичні штами лептоспір, що використовуються в Україні
Таблиця 2. 2 - Вакцинні штами лептоспір та їх серогрупова відповідність
№ п/пСерогрупаСероварШтам1CanicolacanicolaВГНКИ-32IcterohaemorrhagiaeicterohaemorrhagiaeВГНКИ-23HardjohardjoHardjoprajtno4PomonamonjakovВГНКИ-65TarassovitarassoviВГНКИ-46BataviaebataviaeBataviae7SejroesaxkoebingУсольцев8GrippotyphosagrippotyphosaВГНКИ-1
Культивування лептоспір проводили при температурі 28 - 300С.
При посіві на живильне середовище дотримувались пропорції 9:1, де 9 частин складає живильне середовище, 1 частину складає культура лептоспір.
Пересіви на свіже живильне середовище проводили на 7 - 14-ту добу після посіву. Контролювали накопичення біомаси та рухомість лептоспір кожні 3-5 діб, використовуючи мікроскопію у темному полі зору. Контроль за ростом і рухомістю лептоспір проводили кожні 2-5 діб у темному полі зору мікроскопа. Підрахунок накопичення лептоспір (концентрацію лептоспір в культурі) проводили , розводячи дослідну культуру живильним середовищем 1:1 ( до 1см3 культури додавали 1см3 середовища). З отриманого розведення готували препарат "роздавлена крапля" та рахували лептоспіри на кількість під мікроскопом ( збільшення в 150 разів). Підрахунок вели в 15 полях зору по діагоналі препарату, підраховуючи після цього середню кількість в одному полі зору, враховуючи розведення.
Чистоту культури визначали при мікроскопії в темному полі зору і при висівах 0,3- 0,5 см3 культури на МПА, МПБ, МППБ під вазеліновим маслом, Сабуро по три пробірки з кожним середовищем.
2.3. Виробництво сироваток лептоспірозних групоспецифічних аглютинуючих
Сироватки лептоспірозні групоспецифічні аглютинуючі готували для визначення серогрупової та сероваріантної належності штамів лептоспір, для ідентифікації ізолятів із патологічного матеріалу та об'єктів зовнішнього середовища, стандартизації виробничих штамів на біовиробництвах та штамів- антигенів при серологічній діагностиці лептоспірозу.
При виготовленні групоспецифічних аглютинуючих лептоспірозних сироваток використовували 20 діагностичних штамів лептоспір (див. табл. 2.1). В дослідах використовували 7- 10 добові культури лептоспір в концентрації 80- 200 млн/см3. Культури лептоспір вирощували на модифікованому середовищі Кортгофа та модифікованому середовищі EMGH.
Поряд з неконцентрованим антигеном використовували лептоспірозний антиген, який з метою посилення імунологічної відповіді концентрували, використовуючи ультрафільтраційну установку колонкового типу з порожнистими волокнами (детальніше цей метод описаний в п. 2.7.)
Сироватки готували методом гіперімунізації клінічно здорових кролів (Oryctolagus cuniculus) вагою 3-3,5 кг. Вони отримували повноцінний, збалансований за поживними речовинами раціон. Воду давали без обмежень. Тварини попередьно перевірялись на відсутність специфічних лептоспірозних антитіл у РМА. Кролі також не одержували ніяких антибіотиків [71].
Імунізацію кролів проводили шляхом введення матеріалу в крайню вену вуха. На 19, 31 або 35 добу, в залежності від титрів сироваток, після першого введення здійснювали повне знекровлення кролів. Кров збирали при декапітації або із стегнової вени у стерильні пробірки. Перед забором крові стерильні пробірки змочували стерильним фізіологічним розчином для кращого відділення згустку крові. Роботу по відбору крові проводили в умовах максимально наближених до стерильних. Пробірки ставили при 30-370С на 40 хвилин, а потім при 40 С на дві доб