РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконана в 1998 - 2001 роках в лабораторії культур клітин Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук (ІВМ УААН), м. Києва.
2.1. Культури клітин
Роботу з культурами клітин проводили із дотриманням правил асептики в спеціально обладнаних боксах. Обробку скляного посуду, гумових виробів та інших матеріалів необхідних в роботі здійснювали згідно методичних рекомендацій, розроблених в ІВМ УААН [188].
У дослідженнях використовували первинно - трипсинізовані клітини нирки свині (СН), перещеплювані культури СНЕВ (нирка ембріона свині), КТП (тестикули поросят), ВНК - 21 (нирка новонародженого хо'мяка) та ПТП.
Первинно-трипсинізовані клітини СН отримували по загальноприйнятій методиці. Концентрацію клітин в суспензії підраховували в камері Горяєва. Для цього в пробірку брали 0,5 см3 суспензії клітин і добавляли 4,5 см3 середовища чи розчину Хенкса (отримували розведення в 10 раз). Потім цієї розведеної суспензії брали 0,5 см3 і 0,5 см3 трипанового синього (0,5%-вий водний розчин), ретельно перемішували (отримували розведення в 20 раз).
Через 5 хвилин забарвленою сумішшю заповнювали камеру Горяєва. Трипановий синій забарвлює лише мертві клітини, тому підраховували лише незабарвлені блискучі (живі) клітини. Підрахунок проводили при малому збільшенні мікроскопа (окуляр 7, об'єктив 10) в двох і більше сітках по всій площині, а потім виводили середню кількість клітин в одній сітці. Скопичення клітин приймали за одну клітину.
Число клітин в одному см3 визначали по формулі 2.1
( 2.1 ),
де Х - число клітин в 1 см3 суспензії;
а - середня кількість клітин в одній сітці;
n - кратність розведення концентрованої клітинної суспензії;
1000 - число кубічних міліметрів в 1 см3;
0,9 - об'єм сітки камери Горяєва в кубічних міліметрах.
Посівна концентрація клітин при дослідженні становила 3-4 · 105 / см3.
Лінію перещеплюваних клітин тестикулів поросят вивели в лабораторії культур клітин, а перещеплювані культури СНЕВ, КТП та ВНК - 21 використовували із колекції культур клітин ІВМ УААН.
Життєздатність клітин підтримували методом регулярних пересівів [189] на свіже ростове середовище. Пересів культур здійснювали наступним чином. Зливали ростове живильне середовище, ополіскували підігрітим до 38-40°С 0,02%-вим розчином версена. В матрац вносили свіжу порцію версена в кількості, яка необхідна для покриття моношару клітин і поміщали в АСИС (апарат звертання та інактивування сироватки ) при 37°-38°С на 5-10 хвилин. Після того як клітини починають відшаровуватись матрац енергійно струшували і до отриманої суспензії добавляли невелику кількість середовища і брали пробу для підрахунку загальної кількості клітин. Концентрацію клітин в суспензії доводили до посівної та добавляли ростове живильне середовище. Посівна доза в 1 см3 суспензії для 1,5 дм3 матраців складала: для культури СНЕВ 60 - 80 тис. клітин; для культури ПТП 20 - 30 тис. клітин; для культури ВНК 60 - 80 тис. клітин; для культури КТП 80 - 100 тис. клітин. Суспензію клітин в ростовому живильному середовищі засівали в матраци і інкубували при 37°С в термостаті до формування моношару.
Коефіцієнт пересіву матраців для культури СНЕВ складав 1:3 - 1:4, культури ПТП - 1:8 - 1:12, ВНК - 1:3 - 1:4 , КТП - 1:4 - 1:5. При такій схемі пересіву кожна партія клітин протягом тижня пересівалася 1 - 2 рази. В 1,5 дм3 матраці (S ? 300 см2) кількість клітин (мільйонів) становила: СНЕВ - 42-58; ПТП - 40-65; ВНК - 42-50; КТП - 54-68.
Консервування клітин для тривалого зберігання досягалося заморожуванням у рідкому азоті (-196?С). Для заморожування використовували ростове середовище - 90% та кріопротектор - 10% (ДМСО).
Клітини від скла відділяли підігрітим (37-41?С) 0,02% - вим розчином версена, абож сумішшю трипсину та версена в співвідношенні 1:5, двома методами : безцентрифужним та при допомозі центрифугування. Клітини в оптимальній концентрації розливали в ампули, які заповнювали на 2/3 - 3/4 об'єму і запаювали над полум'ям горілки. Після цього формували в касети та поміщали в холодильник при +4?С на 1,5-2 години.
Безпосередньо заморожування проводили в двоступеневому режимі. Перша ступінь: від 4?С до - 40?С, швидкість охолодження при цьому складала 1?С/хв. Друга ступінь: від - 40?С до - 196?С. Ампули швидко поміщали в сосуд Дьюара з рідким азотом.
Розморожування ампул з суспензією клітин проводили шляхом поміщення їх у водяну баню при температурі 40?С на 1,5-2 хвилини. Потім суспензію переносили в матрац для культивування і поступово добавляли ростове середовище. Після підрахунку життєздатних клітин, суспензію доводили до оптимальної посівної концентрації. Для кінцевого видалення кріопротектора і нежиттєздатних клітин через 24 години робили зміну ростового середовища.
2.2. Живильні середовища та розчини
Всі розчини і середовища готували із хімічно чистих солей на бідистильованій і демінералізованій воді. Висока ступінь очистки води, яка призначена для приготування середовищ та розчинів, є необхідною умовою успішної роботи з культурами клітин. Саме тому, не менше одного разу в тиждень, перевіряли її за основними показниками - рН та електропровідність, які повинні бути в межах 6,2 - 6,8 та не більше 1,0-2,0 ·106 Ом відповідно. Воду отримували на іонообмінних установках в день її використання чи напередодні. В останньому випадку воду зберігали у скляній герметично закритій посудині.
При приготуванні розчинів і середовищ використовували наступні хімреактиви:
- Хлористий натрій ( NaCl ) марки " хч ", виробник Михайлівський завод хімреактивів;
- Калія хлорид ( KCl ) марки " хч", виробник Донецький завод хімреактивів;
- Магній сірчанокислий семиводний (MgSO4 x 7H2O) - марки "хч", виробник ООО "Химлаборреактив";
- Магній хлористий (MgCl2 x 6H2O) - марки "хч", виробник ООО "Хи