ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В ходе выполнения работы изучены материалы, опубликованные в литературе, материалы Украинского научно-исследовательского противочумного института им. И.И. Мечникова, а также отчетные материалы и донесения санитарно-эпидемиологических учреждений Украины, посвященные описанию ликвидации эпидемических осложнений по холере.
Изучены материалы, содержащие результаты лабораторного контроля объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов, за период с 1989 по 1999 гг. - официальные отчеты и справки областных санитарно-эпидемиологических станций Украины в количестве: 81 отчетная форма №85, 270 форм №36, 189 форм №2, 27 форм №18).
Для выяснения влияния фитопланктона на свойства и выживаемость вибрионов эльтор была проведена серия экспериментов по совместному культивированию этих микроорганизмов с представителями синезеленых и зеленых водорослей.
Использовали штамм, выделенный от больного в г. Николаеве в 1995 году, № 21 V. cholerae eltor О1, серовар Огава, ctx+, из коллекции УНИПЧИ и штаммы водорослей Platimonas viridis (тип: Chlorophyta, класс: Volvocineae, порядок: Chlamydomonadales, семейство: Chlamydomonadaceae. род: Platimonas) [113] и Synechocystis PCC (тип: Cyanophyta, класс: Chroococceae, порядок: Chroococcales, подпорядок: Coccobactreae, семейство: Coccobactreaceae, род: Synechocystis Sauv.) [114] из коллекции Одесского Национального университета им. И.И. Мечникова. Выбор вышеуказанных штаммов водорослей был связан с тем, что данные штаммы были оксегеничными, т.е. не содержали сопутствующей микрофлоры, которая могла бы оказать влияние на свойства и выживаемость холерных вибрионов.
Изучение сроков сохранности гена ctx и его экспрессии в процессе роста на искусственных питательных средах проводили на 23 токсигенных штаммах (ctx+) V. cholerae О1 из коллекции УНИПЧИ им. И.И. Мечникова (№№ 396, 404, 459, 476, 477, 478, 481, 339, 486, 496, 487, 498, 499, 501, 511, 610, 611, 613, 627, 735, 752, 703, 752), изолированных от больных в период эпидемических осложнений в 1995 г. и хранившихся в течение 6 лет в музейных условиях. Также, после сокультивирования с водорослями исследовали штамм №21.
Сохранность указанных признаков также изучали в условиях культивирования холерных вибрионов при температуре окружающей среды у штаммов №Р-145 и №752.
Уровень токсинообразования определяли на культуре клеток HeLa.
В работе применяли метод эпидемиологического анализа, бактериологические и молекулярно-генетические методы исследования. Все материалы подвергали статистической обработке.
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Распространение холеры в Украине и особенности распространения вибрионов эльтор в объектах окружающей среды изучали с помощью метода эпидемиологического анализа.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Подготовку культуры V. cholerae для экспериментов по совместному культивированию с водорослями производили следующим образом:
Культуру холерного вибриона дважды пассировали на 1% пептонной воде при 37°С 3-4 часа, затем высевали на чашку со щелочным агаром с рН 7,6 - 7,8. Инкубировали при 37°С. Через 18-20 часов готовили густую взвесь агаровой культуры в испытуемой среде и трехкратно отмывали центрифугированием при 8000 об/мин по 5 мин. Отмытую культуру разводили по стандарту мутности 5 ед. (109 м.к./мл). Параллельно контролировали оптическую плотность взвеси на фотоэлектроколориметре (КФК-2МП) (в пределах значений 0,200 - 0,215). Затем последовательным 10-кратным титрованием доводили культуру в пробирках с испытуемой средой до концентрации 102 м.к./мл.
В качестве питательной среды для водорослей и последующего совместного культивирования их с холерными вибрионами использовали модифицированную минеральную среду "С" [143], которую готовили по следующей прописи (г/л):
MgSO4 x 7H2O - 0,250;
K2HPO4 x 3H2O - 0,032;
CaCl2 x 2H2O - 0,036;
FeCl3 x 6H2O - 0,003;
KNO3 - 1,00
Р-р микроэлементов - 1 мл
Вода бидистиллированная до 1 л
рН среды - 7,5.
Среду разливали в колбы по 100 мл.
Культуры водорослей выращивали на вышеописанной среде "С" в режиме постоянного встряхивания на шуттель-аппарате при 150 кач/мин c круглосуточным освещением, при температуре 28°С до получения необходимой концентрации, определявшейся по количеству хлорофилла.
Для определения концентрации хлорофилла пробы по 1 - 1,5 мл центрифугировали в течение 20 минут при 8000 об/мин, надосадочную жидкость отсасывали и вносили в нее 1 мл 80% ацетона. Выдерживали 20 - 24 часа. Определяли оптическую плотность с помощью спектрофотометра. Количество хлорофилла рассчитывали по формуле, предложенной Mac-Kinney в 1941 г. [цит. по 43]:
Са = 12,7*Д663 - 2,69*Д645
где Са - концентрация хлорофилла в мг/л,
12,7 и 2,69 - коэффициенты,
Д - оптическая плотность при разной длине волны.
На основе исходной среды "С" готовили 2 ряда сред для микрокосма "холерный вибрион - водоросли" с различной концентрацией Na+: "С" + 0,5 ммоль NaCl; "С" + 20 ммоль NaCl.
В каждую колбу со 100 мл испытуемой среды вносили по 1 мл взвеси, содержащей 100 микробных клеток холерного вибриона и определяли рН среды с помощью рН-метра "Hanna Checker 1", т/м "Hanna Instruments", Португалия.
Посевы термостатировали при 28°С. Количество жизнеспособных вибрионов определяли параллельным высевом на пластины щелочного агара. Через каждые 48 - 72 часа производили высевы из жидких сред на чашки со щелочным агаром (из каждой среды на 2 - 3 чашки для подсчета среднего количества выросших колоний). Посевную дозу определяли экспериментальным путем с учетом данных первичных нативных высевов таким образом, чтобы получить подлежащее подсчету количество колоний, то есть, при густом росте перед высевом проводили десятикратные разведения в среде культивирования, что учитывали при подсчете результатов. При каждом высеве определяли рН среды с помощью рН - метра.
При достиже
- Київ+380960830922