РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна характеристика матеріалів та методів дослідження
Експерименти виконані на 210 білих щурах-самцях та 20 самках (останні для дослідження репродуктивної здатності тварин) лінії Вістар масою 180-250 г.
Тварин утримували в звичайних умовах віварію за стандартного світлового режиму та харчового раціону. Вибір даного виду тварин ґрунтувався на даних літератури щодо використання білих щурів при вивченні токсичної дії нітратів і нітритів [1,22,45,8].
Проведено п'ять серій дослідів:
1. у першій серії необхідні показники вивчали в інтактних тварин (контрольна серія);
2. у другій, третій, четвертій і п'ятій серіях - після введення нітрату натрію протягом відповідно 2-х тижнів, 1-го, 3-х і 6-ти місяців.
Білих щурів декапітували під ефірним наркозом і вилучали потрібні органи і тканини.
Об'єкти дослідження та показники, що вивчалися, наведено в табл.2.1.
Таблиця 2.1
Об'єкти дослідження і визначені показники
Об'єкти
Показники1212Сім'яникиМаса і ваговий індекс
Гістологічна картина
Стан сперматогенного епітелію
Біохімічні та біофізичні показники енергетичного обміну та вільнорадикального окисненняСперма (суспензія сперматозоїдів із придатку сім'яника)Загальна кількість сперматозоїдів
Сперматограма
Кінезисграма
Життєздатність сперматозоїдівРепродуктивна діяльність самцяЗагальна ембріональна смертність нащадків у першому поколінніКровБіохімічні дослідження вільно-радикального окислення
2.2. Методика відтворення хронічної інтоксикації нітратом натрію
Нітрат натрію вводили тваринам у дозі 200 мг/кг маси тіла у вигляді водного розчину. Введення здійснювали інтрагастрально за допомогою спеціального зонду щоденно протягом 2-х тижнів, 1-го, 3-х та 6-ти місяців.
Біохімічні та біофізичні методи дослідження
Перелік біохімічних та біофізичних методів дослідження сім'яників наведено в табл. 2.2.
Таблиця 2.2
Біохімічні та біофізичні методи дослідження
Параметр, що вивчаєтьсяАвтори методу, літературні джерелаАТФBeutler E. et al. (1975)АДФ, АМФJaworek D. et al. (1974)Фосфат неорганічнийМешкова П.П., Северин С.Є. (1950) Функціональний стан мітохондрійChance B., Williams G.R. (1955) Супероксидний
аніон-радикалЦебржинський О.І. (2002) Оксид азотуАжипа Я.И. (1980) ТБК-реактантиВладимиров Ю.А., Арчаков А.И. (1972) СОДБрусов О.С. и соавт. (1976)КаталазаАрхипова О.Г. (1980) 2.3.1. Визначення концентрації аденіннуклеотидів. Вміст аденозинтрифосфату (АТФ) визначали за методом E.Beutler [130], в основі якого знаходиться вимірювання оптичної густини реагуючих речовин, яка пропорційна вмісту АТФ у пробі.
Вміст аденозинди- та монофосфату (АДФ і АМФ) визначали за методом D.Javoreck et al. [170] в одній пробі за допомогою сполучених реакцій. Метод ґрунтується на тому, що АМФ у присутності АТФ фосфорилюється ферментом міокіназою з утворенням двох молекул АДФ. Молекули АДФ фосфорилюються піруваткіназою за рахунок фосфоенолпірувата, який при цьому перетворюється на піруват, котрий можна визначити за допомогою індикаторної реакції з НАДН та ЛДГ.
Хід виконання реакції полягав у тому, що до спектрофотометричної кювети вносили трис-НCl буфер (рН=7,55), розчин фосфоенолпірувату, який містив йони калію, магнію; розчин НАДН, тканинний екстракт і суспензію ЛДГ.
Через 5 і 1 хв вимірювали оптичну густину - Е1. Потім додавали суспензію піруваткінзи і робили повторні заміри екстинкції через 5 і 2 хв до одержання постійного значення Е2. Зниження екстинкції Е1 -Е2 = ЕАДФ пропорційне кількості АДФ у пробі. Після цього в реакційне середовище вносили суспензію міокінази. Міокіназна реакція завершувалася протягом 25 хв, коли знову реєстрували оптичну густину Е3. Подальше зниження екстинкції відбувалося за рахунок кількісного перетворення АМФ у пробі Е2 - Е3 = ЕАМФ. ЕАДФ та ЕАМФ з урахуванням порожньої проби використовували для розрахунку вмісту АДФ і АМФ у тканині сім'яників.
На основі одержаних результатів обчислювали значення енергетичного потенціалу (ЕП) за формулою D.E.Atkinson [125]:
2.3.2. Визначення концентрації неорганічного фосфату. Вміст неорганічного фосфату (Фн) визначали за методом П.П.Мєшкової і С.Є.Северина [67]. Принцип методу базується на тому, що неорганічний фосфат у сильно кислому середовищі взаємодіє з молібдатом амонію в присутності відновника, утворюючи молібденову синь. Інтенсивність забарвлення при 450 нм прямо пропорційна кількості неорганічного фосфату.
В ході роботи наважку тканини (250 мг), заморожену в рідкому азоті, гомогенізували і переносили в центрифужну пробірку з 3 мл 10% розчину трихлороцтової кислоти на льоду. Екстрагували 20 хв, центрифугували при 1500 об/хв протягом 15 хвилин. До 1 мл центрифугата додавали 1 мл магнезіальної суміші, фенолфталеїн, 10% розчин аміаку до появи блідо-рожевого забарвлення. Через 15 хв центрифугували при 1500об/хв протягом 5-7хв. Надосадову рідину видаляли, до осаду додавали 1 мл дистильованої води і 2-3 краплі магнезіальної суміші. Завісь знову центрифугували. Осад розчиняли в 0,5 мл 0,1н розчину соляної кислоти, додавали 4 мл дистильованої води, 2,5 мл молібдату амонію на 5н розчині сірчаної кислоти та 0,5 мл ейконогена. Об'єм доводили до 10 мл, ретельно перемішували і термостатували 25 хв при 370С. Потім охолоджували та колориметрували. Розрахунки проводили за стандартним графіком, побудованим за розчином дігідрофосфату калію. Вміст неорганічного фосфату визначали в мкмоль/г тканини:
де Фн - вміст неорганічного фосфату (мкмоль/г);
А - кількість неорганічного фосфату (мг);
1000 - коефіцієнт перерахунку в мкг;
4 - коефіцієнт перерахунку на 1 г тканини;
31 - мольна маса фосфору (г/моль).
2.3.3. Визначення стану мітохондріального окислення та фосфорилювання. Після декапітації білих щурів сім'яники швидко видаляли і вміщували на 3-5 хв в охолоджене середовище виділення (-2...0о С)