Розділ 2. Матеріали і методи дослідження
2.1. Cполуки і реактиви, використані в дослідницькій роботі
Дослідження фармакодинаміки іn vіtro і іn vіvo екзогенних лігандів ГАМК- і гліцин медіаторных систем було проведено з використанням агоністів - феназепаму, 5-бром-2'-хлор-2-амінобензофенона (БФ), синтезованих у ПНДЛ-5 Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова, барбіталу-натрія (барбітал натрію), етанолу ("Реахим"), зворотних агоністів: бікукуліну (Sіgma, St.Louіs, MO, USA), коразолу, стрихніну, бензпеніциліну, пікротоксину ("Реахим"). У дослідах іn vіtro були використані протеазa XXIII (Sіgma, St.Louіs, MO, USA) трипсин (Serva, Heіdelberg, Germany), NaCl, СaCL2, Na2PO4, KCl, MgCl2, NaHCO3, глюкоза, KCl, HEPES 10, Cs, Trіs-Cl, EGTA, MgATP, Trіs-он (Merck, Darmstadt, FRG). Інші реактиви виробництва фірми "Chemapol" і вітчизняного виробництва марки ч.д.а та о.с.ч.
2.2. Підготовка тварин до експерименту
Досліди були проведені на мишах нелінійних масою 18-25 г. і пацюках лінії "Вістар" масою 170-300 г. Експериментальні тварини були отримані з розплідника Інституту фізіології ім. А.А. Прочаніна (Київ) і утримувалися на повноцінній лабораторній дієті при природному світловому циклі. Досліджувані водорозчинні сполуки вводили в ізотонічному розчині NaCl, ліпофільні - у твіновій суспензії. Були використані внутрішньоочеревинний і внутрішньовенний спосіб уведення речовин експериментальним тваринам. Контрольним тваринам уводилися відповідні об'єми фізіологічного розчину, твінової суспензії. Електрофізіологічні дослідження іn vіtro проводили на білих пацюках лінії Вистар віком 18-30 днів, що утримувалися на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту фізіології ім. А.А. Прочаніна НАН України. Вибір експериментальних тварин даного віку грунтується на відносній легкості гігаомних контактів між мікропіпеткою і мембраною нейронів і меншою розгалуженістю дендритного дерева, що поліпшує фіксацію потенціалу. Головний мозок молодих тварин легше витримує умови готування препаратів зразків і дозволяє звести до мінімуму вплив травми на реєстрацію синаптичної активності.
2.3. Методи дослідження фармакологічної активності екзогенних лігандів медіаторних систем ЦНС
2.3.1. Визначення порогів чутливості до зворотних агоністів ГАМК-і гліцин-рецепторних комплексів (метод внутрішньовенної інфузії)
Як кількісний показник зміни функцій медіаторних систем іn vіvo використаний метод реєстрації порігових доз (мінімальні ефективні дози - МЕД (мг/кг)) зворотних агоністів: 1% розчину коразолу, 0,02% стрихніну і 0,3% розчину бемегріду при їх внутрішньовенній інфузії з постійною швидкістю, що викликають різні компоненти судомного припадку - клоніко-тонічні судоми (ДКТС), тонічну екстензію (ДТЕ). Протисудомні речовини уводилися внутрішньоочеревинно за 30 хв до введення зворотних агоністів: феназепам у дозах 0,7-2,8 мг/кг, барбітал натрію - 40 - 160 мг/кг, етанол - 1 - 6 г/кг. Оцінка показників ефекту проводилася в кількісній формі (градуйована форма обліку) [156-158].
2.3.2. Електрофізіологічні методи дослідження фармакодинаміки лігандів ГАМКА - медіаторної системи іn vіtro і іn vіvo
2.3.2.1. Електрофізіологічна реєстрація іонних струмів методом "patch-clamp" у конфігурації від "цілої клітини"
Методика проведення електрофізіологічного експерименту на нейронах Пуркін'є мозочка щурів була аналогічна приведеної в [159] і полягала в наступному: після декапітації експериментальних тварин мозочок швидко переносили в чашку Петрі, що містила охолоджений (+5оС) розчин (штучний розчин спиномозкової рідини - ACSF) такого складу (у мілімолях): NaCl - 130; СaCL2 - 2, Na2PO4 - 1,25; KCl - 5; MgCl2 - 1,5; NaHCO3 - 26; глюкоза - 10. Розчин постійно насичували газовою сумішшю 95% О2 / 5% CO2 для підтримки рН на рівні 7,35-7,4. Після охолодження мозочок переносили на покритий фільтрувальним папером плестиглазовий столик з отворами для відсмоктування розчину за допомогою водоструминного насосу. Зразки розміром 400-600 мкм нарізали, використовуючи тонке лезо, потім переносили в посудину з ACSF, що містить протеазу XXІІІ і 1-1,5 мг/мол трипсину. Ензиматичні процедури тривали протягом 30-40 хв при +310 С. Потім зрізи обполіскувалися і тримали в ACSF при кімнатній температурі. Після м'якої обробки тканину пропускали через скляну піпетку і протягом 15-20 хв осаджували клітинну суспензію. Індивідуальні нейрони Пуркін'є легко відокремлюються від інших клітин тканини методом візуалізації.
Електрофізіологічна реєстрація. Струми, викликані прикладенням 500 мкМ ГАМК, реєструвалися методом "patch-clamp" у конфігурації від "цілої клітини", використовуючи скляні мікропіпетки, виготовлені відповідно до методики [118]. Фіксацію мембранного потенціалу здійснювали подачею заданої напруги на два хлор-срібних електроди, один із яких був опущений у міжклітинний розчин, інший у внутрішньоклітинний. Міжклітинний розчин був такого складу (у мілімолях): NaCl - 130; KCl - 5; СаСl2 - 2; MgCl2 - 1,5; глюкоза - 10, HEPES - 10 (pН 7,4 c NaOH). Внутрішньоклітинний розчин (у мілімолях): Cs - 100; NaCl - 10; Trіs-Cl - 30; EGTA - 1; MgATP - 2 (pН 7,25 підтримувався Trіs-ОН буфером). Cs був обраний як основний блокатор К+, що є активатором ГАМКВ-рецептору. Після заповнення мікропіпетки внутрішньоклітинним розчином її опір складав 2-4 мОм. Розчини, що містять ліганди, подавалися відповідно до методики, описаної в [159]. Функціонування каналів реєстрації струмів (аналого-цифровий перетворювач) частота й амплітуда контролювалися за допомогою комп'ютера. Первинну обробку даних (вимір амплітуди, нормалізація і т.д.) проводили за допомогою програми"AnDatRa", мовою Delphі 1.0. Електрофізіологічними показниками були швидкість зміни струму при асоціації речовини з відкритими каналами (?on) і при дисоціації її від блокованих каналів (?off).
Статистичну обробку даних і побудову графіків проводили з використанням програмного пакета Mіcrocal Orіgіn 3.5 (Mіcrocal Software, Іnc., Northampton MA, USA).
2.3.2