РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Вибір об'єктів і методів досліджень в роботі обумовлений її головною задачею - вивченням впливу неорганічних оксидів азоту на агрегатний стан крові.
Для вирішення поставлених задач в роботі використовували методи, що дозволяють всебічно оцінити вплив NO на всі ланки системи гемостазу. Стан системи гемостазу оцінювали на різних експериментальних патофізіологічних моделях - при одноразовому і хронічному введенні екзогенного донора NO - нітриту натрію, а також при інгібуванні NO-синтазної активності блокатором Nw-нітро-L-аргиніном.
Вибір методів дослідження для вирішення задач експериментального розділу дисертації ґрунтувався на результатах аналізу сучасних відомостей про патофізіологію системи зсідання і літературних даних про роль оксиду азоту в гемостазі [34,64,66,125,208-210].
2.1. Методи дослідження системи гемостазу
2.1.1. Біохімічні методи дослідження. Сучасні біохімічні методи досліджень функції гемостазу дозволяють в повній мірі оцінити стан системи: виявити схильність як до тромбоутворення і порушенням мікроциркуляції, так і до геморагій.
Провідна роль в реалізації клітинного гемостазу належить адгезивно-агрегаційної функції тромбоцитів. Стан тромбоцитарно-судинного гемостазу оцінювали по проценту адгезивних тромбоцитів (ПАТ), який визначали за методикою В.П. Міщенко [211], а також по індексу спонтанної агрегації тромбоцитів (ІСАТ) методом А.Taccola [212,213].
Наряду з показниками первинного гемостазу, особливе місце в проведених дослідженнях було приділено вивченню стану коагуляційної ланки системи зсідання з використанням традиційних методик досліджень гемостазу, про що судили по: часу рекальцифікації плазми (ЧР), визначуваному за методом Howell [214]; протромбіновому часу (ПТВ) - за Qulck [214]; тромбіновому часу (ТБ) (за Biggs і Macforlane [215]), активованому парціальному тромбопластиновому часу (АПТВ) (за Caen et al.) [216].
Визначали кількість фібриногену (ФГ) (метод Clauss і Puar) [217]; розчинні фібрин-мономірні комплекси (РФМК) і продукти деградації фібриногену (ПДФ) за допомогою тесту З.С. Баркаган [218]; активність фібрин стабілізуючого фактору (метод В.П. Балуди) [215]; Хагеман-залежний фібриноліз (ХЗФ) (за Kowalski, Kopec) [219]; потенційну активність плазміногену (ТАТ) (метод І.К. Слобожінськой); сумарну (СФА) і неферментативну фібринолітичну активність (НФА) (метод Б.А. Кудряшова і Л.А. Ляпіной) [218] і ферментативну фібринолітичну активність (ФФА), що в повному обсязі дозволяє судити про функціональний стан фібринолізу.
Протеолітичну ланку системи гемостазу оцінювали за вмістом антитромбіна ІІІ (метод Hensen, Loeliger в модифікації К.М. Бішевського) і за протеолітичную активністю (за Shick і Castellino) [214].
Для оцінки ступеня нітритної інтоксикації в створюваних моделях у тварин спектрофотометричним методом визначали концентрацію MetHb крові (метод А.М. Горячковського, К.В. Моїсєєвой) [214] і концентрацію іонів NO2- і NO3- в плазмі крові, використовуючи реактив Грісса [221].
Для біохімічних досліджень використовували набори науково-виробничої фірми "Simko Ltd" і "Біомарк" (м. Львів).
2.1.2. Інструментальні методи дослідження системи гемостазу.
Для дослідження реологічних характеристик крові у людей (in vitro) нами був використаний медичний п'езокристалічний віскозиметричний аналізатор АПР-01 "МЕДНОРД" (Росія). В основі методу лежить реєстрація найзначніших змін агрегатного стану крові, які відображають внутрішні процеси, що протікають в крові при її згортанні і лізисі згустку. Протягом всього дослідження будується крива, яка відображає процес, розраховуються амплітудні і хронометричні константи, що характеризують основні етапи гемокоагуляції і фібринолізу. Побудова графіка змін агрегатного стану крові здійснюється в системі координат, де по осі абсцис відображається час досліджень в хвилинах, а по осі ординат - амплітуда у відносних одиницях (мал. 2.1).
Для характеристики процесу зсідання крові ми враховували:
- початковий показник агрегатного стану крові (An), що відображає інтенсивність початкових етапів гемокоагуляції і вказуючий на концентрацію фібриногену в плазмі;
- час реакції (r), який дозволяє судити про функціональний стан прокоагулянтної ланки системи гемостазу, враховуючи протромбінову активність крові і час початку утворення згустку;
- константу тромбіна (k), що характеризує період утворення згустку;
- показник тромбінової активності (Kk), відповідальний за інтенсивність і динаміку формування кров'яних згустків;
- константу коагуляції (r+k), яка характеризує загальну тривалість згортання крові і тривалість утворення тромбіну;
- константу згортання крові (t), відповідну фазі переводу тромбіном розчинного фібрина-S в нерозчинний фібрин-І;
- константу ущільнення згустку крові (с), що дає уявлення про всю фазу утворення згустку фібрину;
А (відн.од.)
600
500
400
300
200
100
10 20 30 40 50 60 70 80 90 хв.
Аn (a0, t0) - початковий показник
Ar (a1-a0, t2) - інтенсивність спонтанної агрегації тромбоцитів
r (а2, t2- t0) - період реакції
k (а3, t3 -t2) - константа тромбіну
Kk (100/t3 -t2) - показник тромбінової активності
АМ (a4, t4) - фібрін-тромбоцитарна константа крові
Т (а4, t4) - час формування згустку
t (t4 -t3) - константа зсідання
с (a4, t4-t2) - константа ущільнення згустку
F (1- t5/t4) - показник ретракції і лізису
Рис. 2.1. Графік зміни агрегатного стану крові
- фібрин-тромбоцитарну константу крові (АМ), що характеризує структурні реологічні властивості згустку, що утворився;
- константу тотального зсідання крові (Т) - показує функціональний стан не тільки прокоагулянтної ланки гемостазу, але і антикоагуляційну активність;
- сумарний показник ретракції і спонтанного лізису згустку (F), який д