РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Использованные животные
Для экспериментов использовали самцов крыс линии Вистар весом 250-350 г,
содержащихся на стандартном рационе вивария, с соблюдением всех требований
относительно работы с лабораторными животными. Ишемию-реперфузию миокарда (30
мин ишемии и 40 мин реперфузии) моделировали на изолированном сердце животных.
2.2. Экспериментальный протокол
Проведено 2 серии экспериментов, которые были поделены на следующие группы: I
- влияние индукции iNOS на сокротительную функцию миокарда и коронарное
кровообращение при ишемии-реперфузии сердца крысы; II - исследование влияния
донора NO на скорость поглощения кальция везикулами саркоплазматического
ретикулума в гомогенате миокарда крысы.
Экспериментальные группы животных, использовавшиеся при моделировании
ишемии-реперфузии, показаны на рис.2.1.
Проводили 5 серий экспериментов: 1 - контрольная группа: ишемия-реперфузия
изолированного сердца крысы без добавок (n=18); 2 - активация индукции iNOS при
помощи липополисахарида (ЛПС) (Escherichia coli LPS (serotype О26:B6, Sigma,
США)) в концентрации 0,25 мг/кг внутрибрюшинно за 18 часов до начала
эксперимента (n=15); 3 - Специфическая блокада iNOS при помощи PBIT (1.3-PBIT,
phenylene-1.3-bis[ethane-2-isothiourea],
Группа 1 Стабилизация Ишемия Реперфузия
20 минут 30 минут 40 минут
начало перфузии
Группа 2
ЛПС Стабилизация Ишемия Реперфузия
18 часов 20 минут 30 минут 40 минут
Группа 3
ЛПС+PBIT Стабилизация Ишемия Реперфузия
18 часов 20 минут 30 минут 40 минут
PBIT 50 нмоль/л
Группа 4
ЛПС+индометацин Стабилизация Ишемия Реперфузия
18 часов 20 минут 30 минут 40 минут
индометацин
Группа 5 100 мкмоль/л
ЛПС+индометацин
+простагландин Е2 Стабилизация Ишемия Реперфузия
18 часов 20 минут 30 минут 40 минут
ПГE2
индометацин 1 мкмоль/л
100 мкмоль/л
Рис.2.1 Экспериментальный протокол (описание в тексте).
Sigma, США), который подавали в перфузионный раствор в конечной концентрации 50
нмоль/л (n=6); 4 - Блокада циклооксигеназы (COX) неспецифическим блокатором
индометацином (indomethacin, Sigma, США), который подавали в перфузионный
раствор в конечной концентрации 100 мкмоль/л (n=9); 5 - влияние на фоне
введения индометацина простагландина Е2 (prostaglandin E2, Sigma, США), который
вводили в перфузионный раствор в концентрации 1 мкмоль/л со скоростью 1 мл/мин
на протяжении последних 5 минут перед ишемией через микрокатетер
непосредственно в канюлю, на которой подвешено сердце (n=6).
Изолированные сердца животных всех групп адаптировали к условиям перфузии 20
минут (период стабилизации). После того, как сократительная функция
стабилизировалась, полностью прекращали подачу перфузионного раствора на 30
минут – беспоточная нормотермическая глобальная ишемия. После этого перфузию
возобновляли и продолжали 40 минут (период реперфузии), наблюдая восстановление
сократительной функции сердечной мышцы.
После моделирования каждого этапа ишемии-реперфузии [после периода
стабилизации показателей кардиогемодинамики – через 20 минут; после ишемии –
через 20+30 минут; после реперфузии – через 20+30+40 минут от начала перфузии]
изолировали левый желудочек с межжелудочковой перегородкой и правый желудочек
сердца, немедленно помещали материал в жидкий азот для использования в
биохимических исследованиях и вестерн-блот-анализе.
2.3. Перфузия изолированного сердца
Для наших исследований мы использовали модель ex vivo с целью изучения влияния
индукции iNOS именно на миокард. Функция изолированного сердца определялась по
методике Лангендорфа [85].
Рис. 2.2. Схема установки для экспериментов на изолированном сердце крысы по
методике Лангендорфа (ретроградная перфузия):
А - резервуары, содержащие раствор Кребса-Хензелейта для перфузии сердца
В - перистальтические насосы
С - теплообменная камера
D - термостатируемая камера для сердца
Е - регистратор
F - воздушная камера
G1, 2 - датчики давления
Н - внутрижелудочковый латексный балончик
Животных анестезировали внутрибрюшинно уретаном (125 мг/кг веса животного) и
затем внутрибрюшинно вводили гепарин (250 ед/кг веса животного) за 10 минут до
извлечения сердца. Животным вскрывали грудную клетку надрезом под мечевидным
отростком с последующим разрезом до ключицы на уровне места прикрепления ребер
к грудине справа.
После торакотомии сердце быстро извлекали и помещали в модифицированный раствор
Кребса при температуре 8-10°С. Сердце подвешивали, канюлируя аорту, для
перфузии и отмывали модифицированным раствором Кребса (37°С, рН=7,4) в полой
термостатируемой камере (37°С) в течение 5 минут. Схема перфузии препарата
изолированного сердца пре