РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали і методи досліджень
Роботу виконано на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету. Окремі дослідження проведено у лабораторіях Інституту інфекційних хвороб МОЗ України, лабораторіях імунології та біохімії НДІ екогігієни і токсикології ім. Л.С. Медведя МОЗ України, навчально-дослідних господарствах НАУ (Навчально-дослідне господарство "Великоснітинське" та Агрономічна дослідна станція) розташованих у відповідно Фастівському та Васильківському районах Київської області.
Як тварин-донорів трансфер-фактору антирабічного використали свиней породи велика біла, масою тіла 80 - 90 кг, віком 7 - 8 міс. Як тварин-реципієнтів використовували білих нелінійних мишей масою 18 - 20 г та нелінійних морських свинок масою 250 - 300 г. Всього використано 20 голів свиней, 100 морських свинок та 300 білих мишей.
Для імунізації тварин з метою отримання трансфер-фактору та вивчення реакцій клітинного та гуморального імунітету при введенні антирабічної вакцини застосовували інактивовану концентровану антирабічну культуральну вакцину КоКАВ, на основі виробничого штаму вірусу сказу Внуково-32, виробництва НДІ поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН.
Як антиген при вивченні протективних властивостей трансфер-фактору антирабічного використовували вірулентний штам вірусу сказу CVS.
При вивченні ад'ювантних властивостей препарату трансфер-фактору за антирабічної імунізації лабораторних тварин використовували вакцину антирабічну інактивовану суху культуральну із штаму "Щолково 51-К" серія № 2 (Херсонська державна біофабрика).
Як алерген для постановки реакції гіперчутливості сповільненого типу використовували вакцину КоКАВ та інактивований вірус сказу штаму CVS.
2.1.1. Реактиви та обладнання
Живильні середовища Ігла МЕМ, 199, РПМІ ; сольовий розчин Хенкса з феноловим червоним, антибіотики (стрептоміцину сульфат, бензилпеніциліну натрієва сіль, гентаміцину сульфат); лейкоцити миші, кроля, лімфоцити морської свинки, свині, еритроцити кроля, барана. Панкреатична ДНК-аза-1 фірми "SERVA", пероксидаза хрону і напівпроникні діалізні мембрани з пропускною здатністю до 10 000 Да фірми "SIGMA"; лабораторні центрифуги, рідина Тюрка, апірогенний фізіологічний розчин 0,85 % NaCl, розчин Фікол-Пак, розчин гепарину, агароза, розчин етанолу 95 %, метанол, розчин формальдегіду 35 %, фітогемаглютинін, культура E.coli, фотозбільшувач, мікропланшети культуральні фірми "NUNC", спектрофотометр вертикальний Labsystem Multiscan MS, гомогенізатор MPW-320, штангенциркуль, скляний та пластиковий посуд; шприци ін'єкційні.
2.1.2. Отримання трансфер-фактору
На початковому етапі дослідної роботи були розроблені схеми імунізації тварин-донорів, які обумовлювали продукцію трансфер-фактору специфічного щодо вірусу сказу в їх організмі, який має здатність до переносу активного клітинного антирабічного імунітету інтактним реципієнтам.
2.1.2.1. Визначення оптимальної схеми вакцинації тварин-донорів
Як тварин-донорів трансфер-фактору використовували свиней породи велика біла обох статевих груп, живою масою 80 - 90 кг та віком 7 - 8 місяців. Вибір тварин був зумовлений такими критеріями : можливість отримання значної кількості лімфоїдної тканини і, відповідно, лейкоцитарної маси, а також тим, що для даного виду тварин не характерна захворюваність на губчасту енцефалопатію, що гарантує певний рівень безпеки щодо даної пріонної інфекції.
Як специфічний антиген для імунізації свиней-донорів використали концентровану культуральну інактивовану очищену антирабічну вакцину (КоКАВ) серії № 237 з індексом імуногенності > 2,5 МО виготовлену з штаму "Внуково-32" Інститутом поліомієліту і вірусних енцефалітів РАМН.
Дослід проводили на свинарських фермах, вільних від лептоспірозу та інших інфекційних захворювань. Для проведення дослідження за принципом аналогів сформували три групи тварин, по 6 голів в кожній. Свиней першої групи імунізували одноразовим введенням вакцини. Тваринам другої групи вакцина вводилася триразово - на першу, сьому та 21-у добу. Третій групі замість вакцини вводили стерильний апірогенний 0,85% розчин NaCl.
Препарат вводили внутрішньом'язово в дозі 1,5 см3 у привушну ділянку в області каудального косого м'яза голови. Забій тварин першої групи і відбір матеріалу для виготовлення діалізного екстракту лімфоцитів проводили на 7 добу після одноразового введення вакцини, другої - на 7 добу після третьої вакцинації, третьої - одночасно з тваринами другої групи. Забивали по 3 тварини з кожної групи.
Визначення антитіл, специфічних щодо збудника сказу.
Визначення концентрації антитіл, специфічних щодо вірусу сказу в сироватці крові дослідних тварин, проводили за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу із застосуванням тест-системи діагностичної імуноферментної "ІФА RABIES AB", виготовленої в умовах лабораторії, мікробіології, вірусології та імунобіотехнології НАУ (ТУУ 24.4). Кров для досліджень відбирали до ін'єкції, через 6 діб після одноразового та через 6 діб після триразового введення вакцини.
Для проведення аналізу у всі лунки полістиролової планшети вносили по 0,035 мл розчину для промивання, який готували безпосередньо перед застосуванням, підігріваючи до 370 С до повного розчинення кристалів. Стрипи витримували залитими по 30 - 40 секунд і видаляли розчин за допомогою промивача. Потім вносили по 0,095 мл розчину для розведення сироваток і додавали по 0,005 мл зразків досліджуваних сироваток від вакцинованих свиней, залишивши вільними п'ять лунок першого ряду ( лунки для контролю ). У дві лунки (A1, B1) вносили по 0,005 мл позитивних сироваток (К +), а в три інші (D1 - E1) - по 0,005 мл негативних (К -). При внесенні контрольних та досліджуваних зразків сироватки проводили піпетування суміші. Після внесення сироваток накривали планшет кришкою та інкубували при температ