РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ОБСТЕЖЕННЯ
Робота виконана на базі відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України та
дитячої обласної лікарні м.Мукачево Закарпатської області.
Клінічний матеріал складав 159 дітей раннього віку з низинних та високогірних
районів області. З них 110 дітей із синдромом ГТ; в періоді запального процесу
(ОБ) - 52 дітей, в періоді клінічного спокою – 58 дітей. Групу порівняння
склали 49 дітей раннього віку з рецидивуючим обструктивним бронхітом (РОБ) та
20 клінічно здорових дітей тієї ж вікової групи.
Верифікація ГТ базувалася на даних анамнезу, характерних клінічних проявах,
результатах ультразвукового, рентгенологічного обстеження, а також
лабораторного та імунологічного дослідження.
Загальноклінічні методи складались з анамнезу хвороби та життя, особливостей
анте-, пре-, перинатального анамнезу, даних клінічного огляду з ретельними
фізикальними дослідженнями. Використовувались лабораторні методи:
загальноклінічні аналізи, розширена гемограма, протеїнограма, вірусологічне
обстеження змивів з носу, бактеріальний засів мокротиння, мазки із зіва на
гриби, імунологічне обстеження, визначення інтерферонового статусу.
Усі діти консультувалися оториноларингологом, неврологом, кардіологом,
ортопедом, пульмонологом; значна кількість дітей консультована
гастроентерологом, гематологом, генетиком, ендокринологом, онкологом. У звґязку
з важкістю стану деякі діти були оглянуті реаніматологом.
2.1. Методи діагностики гіперплазії тимусу.
Діагностику ГТ проводили за допомогою таких інструментальних методів:
рентгенологічного обстеження органів грудної клітки та ультразвукового
сканування тимусу.
При використанні рентгенологічного методу оцінка розмірів тимусу проводилась на
рентгенограмах грудної клітки у двох проекціях. Збільшеною вважалась загрудинна
залоза, якщо в середостінні візуалізувалась характерна тінь, розташована з
одного або двох боків судинного жмутика, при кардіо-тиміко-торакальному індексі
(КТТІ), що перевищував величину 0,33 у хлопчиків, 0,35 – у дівчаток та
вазокардіальному індексі, котрий перевищував 60% (Тяжкая А.В., 1988).
УЗО тимусу проводилось з використанням конвексного датчика 5,5 МГц. При
визначенні об’єму та маси застосовувалась методика Л.Г.Кузьменко (1994). При
ультразвуковому скануванні була змога визначити не лише параметри, масу та
обґєм долів тимусу, але й оцінити його структуру. Загрудинна залоза оцінювалась
в поперечному та поздовжньому розмірах. Обґєм залози визначався по множенню
трьох розмірів – довжини, ширини, товщини кожної долі та коефіцієнту 0,5
(Кузьменко Л.Г. с соавт., 1994). Маса залози обчислювалась множенням обґєму на
коефіцієнт 0,7. ( Дворяковский Н.Г с соавт., 2000).
2.2. Визначення інфекційних чинників.
З метою етіологічної експрес-діагностики та визначення обсіменіння дихальних
шляхів респіраторними вірусами у дітей обстежених клінічних груп проводилися
вірусологічні дослідження із застосуванням імунофлюоресцентного методу
визначення та ідентифікації вірусних антигенів. Визначення вірусних антигенів у
клітинах центрифугата змивів з носа проводили за загальноприйнятим методом
Кумбса у прямій модифікації із застосуванням флюорисцуючих імуноглобулінів для
діагностики ГРЗ (аденовірусний, парагрипозний, респіраторно-синтиціальний).
Результати підраховували за допомогою люмінесцентного мікроскопа.
Засіви мокротиння проводились на стандартні середовища. Для визначення
бактерійної мікрофлори – на кров’яний агар, грибів роду Candida – агар Сабуро
(“Калі”, Київ). Чутливість до антибіотиків визначалась за допомогою дисків
(“Аспект”, Київ).
Визначення антитіл вірусів герпесу І, ІІ типів (ВПГ) проводили за допомогою
тест-системи “ВектоВПГ-IgG-стрип” ІФА-методом; цитомегаловірусу (ЦМВ) визначали
тест-системою “ВектоЦМВ-IgG-стрип” (ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибірськ).
Результати ІФА реєстрували за допомогою спектрофотометру, вимірюючи оптичну
щільність (ОЩ) на довжині хвилі 450 нм ( ІgG ВПГ) та 492 нм (Ig G ЦМВ). ОЩ
контролю 0,1.
2.3. Оцінка показників імунного статусу.
2.3.1. Оцінка інтерферонового статусу організму.
Оцінку інтерферонового статусу організму як відображення функціонального стану
системи інтерферону проводили за трьома основними показниками – концентрацією
інтерферону (ІФН) у сироватці крові; рівнем продукції ІФН-a лейкоцитами in
vitro у відповідь на індукцію вірусними індукторами; рівнем продукції ІФН-g
лімфоцитами in vitro у відповідь на індукцію мітогенами. У роботі
використовували культуральні середовища: RPM1-1640 або середовище 199; глютамін
(0,3мг/мл), фетальну телячу сироватку, антибіотики (гентаміцин або пеніцилін,
стрептоміцин по 100 ОД/мл), ФГА-0 (“Difco”, США), гепарин, 1н HCl, 1н NaOH,
вірус везикулярного стоматиту (ВВС).
Дослідження вмісту ІФН проводили мікрометодом. Готували культуральне середовище
RPMІ-1640, або середовище 199, яке містило 10% мМ. HEPES 1% глютаміну, 50 мкМ
меркаптоетанолу і 100 ОД/мл антибіотиків.
Для визначення продукції ІФН гепаринізовану венозну кров розводили
культуральним середовищем у співвідношенні 1:4 і вносили по 0,5 мл у лунки
24-лункової культуральної панелі. Для індукції ІФН-a до проб добавляли 0,1 мл
суспензії вірусу хвороби Ньюкастла, а ІФН-g – 0,5 мл культурального середовища,
що містило 40 мкг/мл ФГА, та інкубували відповідно протягом 24 або 48 год. при
370С в атмосфері з 5% СО2. Після інкубації клітини осаджували центрифугуванням
протягом 10 хв. при 1500 об/хв. У пробах з ІФН-a вірус інактивували 1н. HCl,
витримували 72 год., після чого рН середовища доводили до 7,0 1н NaOH. Для
- Київ+380960830922