РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Групування дослідів
Для вирішення поставлених задач було проведено експериментальні дослідження процесів апоптозу тимоцитів на 95 тимусах свиней породи Полтавська біла віком 10-12 місяців, 16 тимусах мишей NOD і BALB/c in vitro; та на 24 мишах лінії NOD віком 10-12 тижнів, 43 мишах лінії BALB/c того ж самого віку масою 15-25 г in vivo.
Враховуючи етичні та технічні труднощі виділення тимоцитів людини, сучасні тенденції науки з використанням тканинних культур, вивчення процесів апоптозу тимоцитів було проведено на культурі клітин тканини тимуса свиней породи Полтавська біла віком 10-12 місяців in vitrо, яку підтримували протягом 24 год при +370 С в стандартних умовах інкубації. Відомо, що основну масу (85%) популяції лімфоцитів тимуса молодих тварин складають кортикальні тимоцити - дубль-позитивні CD4+CD8+ клітини, із яких біля 30% здатні до клітинної загибелі [42].
У відповідності до поставлених задач, першим етапом досліджень було вивчення впливу тималіну і пептидного комплексу нирок на процеси апоптозу тимоцитів за фізіологічних умов. Для дослідження у цій серії було взято 21 тимус. Контролем слугували тимоцити, інкубовані 24 год в середовищі культивування. Комплекс пептидів тимусу - тималін та ПКН використовували в кінцевій концентрації 0,12 мкг/мл відповідно, що була встановлена в попередніх дослідженнях, як мінімальна ефективна доза [19]. Розчини препаратів готували в концентрації 1,2 мкг/мл, а потім додавали до інкубаційного середовища відповідно до кінцевої концентрації 0,12 мкг/мл та інкубували 24 години при +370 С.
Далі проводили дослідження дії тималіну і ПКН на процеси апоптозу тимоцитів за умов модуляції активності їх внутрішньоклітинних регуляторних систем. Враховуючи універсальну роль апоптозу в процесі становлення та функціонування імунної системи, нами була вибрана модель індукованого апоптозу тимоцитів для розкриття молекулярних механізмів дії пептидних комплексів тимуса - тималіну і нирок. З цією метою були використані індуктори та інгібітори внутрішньоклітинних регуляторних систем, здатні впливати на розвиток процесів апоптозу [250], а також є основними месенджерними системами в передачі сигналів від дії біологічно активних речовин, в тому числі пептидної природи [165].
Глюкокортикоїди - фізіологічні і найбільш поширені індуктори апоптозу тимоцитів, основна маса яких дуже чутлива до їх дії [251]. Надниркові гормони та їх синтетичні похідні пасивно проникають через клітинну мембрану і через специфічні глюкокортикоїдні рецептори ядра справляють прямий генотоксичний вплив. Вивчали роль пептидів за умов дексаметазон-індукованого апоптозу тимоцитів [84], який відтворювали внесенням в середовище культивування дексаметазону (SIGMA, USA) до кінцевої концентрації 10-7М і інкубували протягом 24 годин при +370 С.
Виходячи із даних літератури, що апоптоз тимоцитів відбувається в основному протеїнкіназа С- та кальцій-залежними шляхами, було досліджено вплив пептидів тималіну та ПКН в умовах активації протеїнкінази С та модуляції кальцієвої системи [78]. Активацію протеїнкінази С відтворювали шляхом додавання до суспензії клітин 4-форбол-12-мірістат-13-ацетату (ФМА) (SIGMA, USA), активатора протеінкінази С [84]. Внесення ФМА - синтетичного аналога діацилгліцеролу (ДАГ), призводить до активації протеінкінази С, за допомогою якої відбувається фосфорилювання в присутності кальцію залишків серину і треонину внутрішньоклітинних білків і передача сигналу до ядра клітини. В середовище культивування вносили ФМА до кінцевої концентрації 8,1 x 10-9M та інкубували протягом 24 годин при +370 С.
Дослідження дії пептидів за умов індукції входу іонів кальцію всередину клітини проводили шляхом додавання до суспензії клітин кальцієвого іонофору А23187 (SIGMA, USA) [84]. Кальцієвий іонофор А23187 здатний до комплексоутворення з кальцієм у гідрофобній фазі, завдяки чому він опосередковує електронейтральний трансмембранний перенос двохвалентного катіону (Ca2+) в обмін на інший двохвалентний катіон або два протони. В середовище культивування вносили іонофор А23187 до кінцевої концентрації 2 x 10-7 М і інкубували протягом 24 годин при +370 С.
Для з'ясування, чи залежать біологічні ефекти пептидів від наявності іонів кальцію всередині та ззовні клітини, було відтворено умови блокади іонів кальцію.
З метою зв'язування внутрішньоклітинного кальцію до суспензії клітин додавали 1,2-біс(амінофеноксі)етан-N,N,N",N"-тетраацетіл (ВАРТА) (''ICN Biomedicals", USA) [84]. ВАPТА завдяки наявності гідрофобних властивостей здатний проникати всередину клітини і зв'язувати внутрішньоклітинний кальцій. В середовище культивування вносили ВАРТА до кінцевої концентрації 5 x 10-3 М та інкубували протягом 24 годин при +370 С.
Блокаду зовнішньоклітинного кальцію здійснювали шляхом внесення до суспензії клітин етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) (SIGMA, USA) [242]. Натрієва сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) здатна до хелатування іонів кальцію та магнію в позаклітинному просторі. В середовище культивування вносили ЕДТА до кінцевої концентрації 2,5 x 10-2 М і інкубували протягом 24 годин при +370 С.
За даними літератури, показана висока чутливість тимоцитів на різних етапах дозрівання до зміни цАМФ, та здатність пептидів тимуса впливати на внутрішньоклітинний вміст цАМФ [252]. Тому нами було проведено дослідження ролі пептидів при блокаді фосфодіестерази, що досягалося додаванням до суспензії клітин теофіліну (SIGMA, USA) до кінцевої концентрації 10-3 M і інкубували протягом 24 годин при +370 С.
Теофілін інгібує фермент фосфодіестеразу, що перешкоджає розпаду цАМФ та веде до накопичення циклічного 3/ , 5/-аденозинмонофосфату (цАМФ) в клітинах [253].
Дослідженення було проведено на культурі клітин тканини тимусу свиней породи Полтавська біла віком 10-12 місяців in vitrо. Суспензію клітин кожного тимусу досліджували в 6 серіях: 1- контрольна (тимоцити в середовищі культивування); 2- внесе
- Київ+380960830922