РОЗДІЛ 2
ОБ’ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Враховуючи мету і завдання, поставлені в дисертаційній роботі, а також сучасні
уявлення про патогенез і принципи лікування токсичних уражень організму, нами
вибрано наступний методологічний підхід та комплекс лабораторних методів
дослідження.
2.1. Відбір тварин для дослідження
Досліди проведені на білих статевозрілих безпородних щурах-самцях масою тіла
180-200 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. В процесі роботи
використано 165 тварин.
Моделлю екзотоксикозу служила гостра інтоксикація тварин етанолом на тлі
ураження солями важких металів.
Токсичне ураження викликали шляхом внутрішньошлункового введення тваринам
водного розчину кадмію хлориду в дозі 3,3 мг/кг маси тіла (0,05 LD50) та свинцю
ацетату в дозі 11 мг/кг (0,05 LD50) протягом 30-ти діб [318]. Гостре алкогольне
отруєння моделювали шляхом одноразового внутрішньочеревного введення етилового
спирту, який попередньо розводили в 0,9 % розчині натрію хлориду, з розрахунку
12,5 мл 40 % розчину етанолу на 1 кг маси [319] на 31-у добу експерименту.
Інтактним тваринам вводили відповідну кількість 0,9 % розчину натрію хлориду.
Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи:
І – інтактні; ІІ – тварини, уражені етанолом; ІІІ – тварини, уражені кадмію
хлоридом і свинцю ацетатом; IV – щурі, уражені кадмію хлоридом, свинцю ацетатом
та етанолом; V– тварини, уражені кадмію хлоридом, свинцю ацетатом та етанолом,
яким проводилась корекція токсикозу карнітину хлоридом; VІ – щурі, уражені
кадмію хлоридом, свинцю ацетатом та етанолом, яким проводилась корекція
токсикозу карнітину хлоридом та ентеросорбентом “Альгігель ”.
Утримання тварин та експерименти проводилися у відповідності до положень
"Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для
експериментальних та інших наукових цілей" [320].
Тварин декапітували під тіопенталовим наркозом на третю, п’яту та сьому доби
від моменту припинення ураження. Дослідженню підлягали цільна кров, плазма
крові, сироватка крові й гомогенат печінки.
З метою корекції викликаних порушень внутрішньочеревно вводили 2 % розчин
карнітину хлориду, в дозі 50 мг/кг у всі дні проведення експерименту [297].
Ентеросорбент “Альгігель” (альгінат натрію) вводили внутрішньошлунково в дозі
400 мг препарату [321] щоденно на протязі всього терміну експерименту.
2.2. Дослідження показників білкового обміну
Визначення концентрації загального білка біуретовим методом.
Принцип методу полягає у здатності білків реагувати в лужному середовищі з
сірчанокислою міддю з утворенням сполук фіолетового кольору (біуретова реакція)
[322]. Інтенсивність забарвлення розчину прямо пропорційна вмісту білків в
плазмі крові.
До 0,1 мл плазми крові (або гомогенату печінки) додавали 5 мл біуретового
реактиву, змішували, уникаючи утворення піни. Через 30 хвилин визначали оптичну
щільність проби за допомогою фотоелектроколориметра (кювета з довжиною
оптичного шляху 10 мм) при довжині хвилі 540 нм проти контрольного розчину,
який готували шляхом додавання до 5,0 мл біуретового реактиву 0,1 мл 0,9 %
розчину NaCl.
Розрахунок проводили за формулою:
С = Ск Ч Ед/Ек (2.1),
де С – концентрація білка, г/л
Ск – концентрація білка в калібрувальному розчині, г/л
Ед – оптична щільність дослідної проби
Ек – оптична щільність калібрувальної проби
2.2.2. Визначення фракцій білків сироватки крові методом електрофоретичного
розділення на агарозі.
Метод ґрунтується на різній рухливості білків в електричному полі, залежно від
заряду та молекулярної маси білка [322].
У дві частини електрофоретичної камери наливали по 150 мл розведеного
вероналового буферу, обережно виймали гелеву пластинку з пакета і ложили на
листок паперу. Місце нанесення сироватки просушували шляхом швидкого
прикладання фільтрувальної смужки. На осушене місце розміщували фольгу
(трафарет) для нанесення проб, після чого в розрізи наносили розведену
сироватку крові (1 частина сироватки + 6 частин буфера) дозатором по 0,005 мл і
залишали на 5 хв з моменту нанесення останньої проби. Надлишок сироватки
видаляли за допомогою смужки фільтрувального паперу, фольгу обережно знімали,
пластину з агарозою згинали і поміщали її в камеру гелем вниз (так, щоб місце
нанесення сироватки знаходилось зі сторони катоду), після чого закривали камеру
кришкою. Електрофорез проводили 20 хв при напрузі 100 В. Після закінчення
електрофорезу пластинку виймали і занурювали у ванночку з фіксажем на 15 хв,
після чого її висушували, занурювали у ванночку з барвником на 10 хв та 2 – 3
рази знебарвлювали. Знебарвлену пластинку промивали дистильованою водою і
висушували. Електрофореграми розшифровували за допомогою денситометра.
2.2.3. Визначення сечовини.
Визначення сечовини проводили згідно методу [322]. Принцип методу полягає у
тому, що сечовина в присутності тіосемикарбазиду і солей заліза в кислому
середовищі утворює комплекс з диацетилмонооксимом, інтенсивність забарвлення
якого пропорційна вмісту сечовини в досліджуваній біологічній рідині.
В пробірку вносили 0,01 мл плазми крові, додавали 1 мл розчину
диацетилмонооксиму та 1 мл розчину тіосемикарбазиду (попередньо приготувавши їх
з відповідних концентрованих розчинів, які входять в склад набору). Паралельно
готували контрольну (додають калібрувальний розчин сечовини) і холосту (додають
фізіологічний розчин) проби. Вміст пробірок перемішували і ставили в киплячу
водяну баню на 10 хв, потім охолоджували протягом 2 хв проточною холодною
водою. Оптичну густину реєстрували на фотоелектроколориметрі КФК-3 при довжині
хвилі 560 нм в кюветі 10 мм проти холостої проби.
- Київ+380960830922