РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены на 228 крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г, возрастом 3-4 месяца.
Таблица 2.1
Распределение животных по сериям эксперимента в соответствии с задачами исследования
п/пСерии экспериментовКоличество животных1.Эозинофильная реакция при карагиненовом остром асептическом воспалении842.Реакции системы крови и морфофункциональное состояние тучных клеток при воспалении на фоне эозинофилии843.Роль тучных клеток в эозинофильной реакции при остром воспалении60
До начала эксперимента животных в течение 1-2 недель выдерживали в виварии на обычном водном и пищевом рационе ad libitum по 6 особей в стандартных металлических клетках. Для исключения влияния сезонных и суточных колебаний на изучаемые показатели основные исследования были проведены в осенне-зимний период, в утренние часы. Животных умертвляли декапитацией.
Все процедуры с животными, а также выведение их из эксперимента проводили под анестезией с использованием диэтилового эфира в соответствии с национальными "Общими этическими принципами опытов на животных" (Украина, 2001), которые согласуются с положениями "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, 18.03.1986 г.), а также Хельсинкской декларацией, принятой Генеральной ассамблеей Всемирной медицинской ассоциации (1964-2000 гг.) и Уставом Украинской ассоциации по биоэтике и нормами GLP (1992 г.), типовым положением по вопросам этики МЗ Украины № 66 от 13.02.2006 г.
Использовали минимально допустимое для статистической обработки и получения достоверных результатов общепринятое количество животных (по 6 на группу), а также минимально достаточное для достижения цели и решения задач исследования количество экспериментальных групп, т.е. общее количество животных.
2.1 Воспроизведение воспаления. Моделью воспаления служил острый асептический перитонит, вызываемый внутрибрюшинным введением 5 мг ?-карагинена в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Раствор карагинена перед введением стерилизовали автоклавированием при 1210С в течение 15 мин [159]. Животных забивали через 5, 15, 30 мин, 3, 6, 12 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 10 сут. Сроки воспаления отсчитывали от момента введения флогогена. У животного забирали кровь, экссудат, костный мозг.
Критерием воспаления служила клеточная динамика экссудата, костного мозга и периферической крови.
2.2 Определение общего количества лейкоцитов (ОКЛ) и клеточного состава экссудата. О лейкоцитарной реакции очага воспаления судили на основании определения ОКЛ в брюшной полости и клеточного состава экссудата.
Экссудат получали промыванием брюшной полости крыс 5 мл раствора Тироде (или изотонического раствора NaCl), содержащего 5 Ед/мл гепарина. Подсчет ОКЛ в брюшной полости производили с помощью камеры Горяева [160].
О клеточном составе очага воспаления судили на основании определения количества нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и лимфоцитов в экссудате.
Подсчет относительного количества нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и лимфоцитов в экссудате производили в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, с последующим перерасчетом на абсолютные величины на основании ОКЛ [160].
2.3 Определение общего количества кариоцитов (ОКК) и клеточного состава костного мозга. Костномозговое кроветворение изучали путем подсчета ОКК в костном мозге бедра и клеточного состава костного мозга.
Для получения костного мозга выделяли бедренную кость крысы, очищали ее от мягких тканей и тщательно промывали костномозговой канал 1мл 3 % уксусной кислоты, содержащей гепарин (50 ЕД/мл) и подкрашенной генцианвиолетом. Для определения ОКК использовали меланжерный метод. 1 мкл суспендированного костного мозга набирали в меланжер для белой крови и разводили 3 % уксусной кислотой. Подсчет общего количества миелокариоцитов на бедро осуществляли с помощью камеры Горяева.
Клеточный состав костного мозга исследовали путем подсчета миелограмм в мазках костного мозга. Для этого костный мозг выдавливали из дистального конца бедренной кости на обезжиренное стекло и разводили изологической сывороткой. Мазки фиксировали в метаноле и окрашивали азуром ІІ-эозином по методу Романовского-Гимзы. Подсчитывали количество бластных клеток, зрелых и незрелых нейтрофильных гранулоцитов, эозинофилов, моноцитов, лимфоцитов, эритроидных клеток и мегакариоцитов [160]. Процентное содержание кариоцитов перерасчитывали на абсолютное количество клеток на основании ОКК.
2.4 Определение общего количества лейкоцитов и их клеточного состава в периферической крови. О лейкоцитарной реакции периферической крови судили на основании определения ОКЛ и лейкоцитарной формулы.
Подсчет ОКЛ осуществляли с помощью камеры Горяева, для определения лейкоцитарной формулы мазки крови фиксировали в метаноле и окрашивали азуром II-эозином [160]. Процентное содержание лейкоцитов перерасчитывали на абсолютное количество клеток на основании ОКЛ.
2.5 Подсчет и морфологическое изучение ТК перитонеальной жидкости. В видалевской пробирке смешивали 0,09 мл перитонеального смыва и 0,01 мл 0,3 % спиртового раствора нейтрального красного. С целью облегчения подсчета при большом общем количестве клеток в экссудате смешивали 0,05 мл перитонеального смыва, 0,04 мл раствора Тироде и 0,01 мл нейтрального красного. С помощью камеры Горяева при увеличении х400 подсчитывали абсолютное и относительное количество ТК в перитонеальной жидкости, а также процентное содержание дегранулированных ТК, с учетом интенсивности их дегрануляции [161, 162].
2.6 Определение активности ЭПО. О функциональной активности эозинофилов очага и периферической крови судили на основании активности маркерного фермента эозинофилов - ЭПО, которую определяли цитохимическим методом [102, 157].
В раствор