ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Современные методы в биотехнологии создания церебропротекторов с
антиоксидантным и стресспротективным механизмом действия.
Процесс поиска и создания новых лекарственных средств делится на 4 этапа:
- поиск и конструирование веществ- лидеров, оптимизация веществ- лидеров,
синтез новых биоактивных субстанций;
- доклинические исследования (фармакологический и токсикологический скрининг);
- клинические исследования;
- внедрение лекарственного средства в медицинскую практику [194, 196].
В последнее время разработаны новые технологии, которые радикально изменили
начальный этап создания лекарственных средств. Среди них: компьютерные
технологии конструирования, комбинаторная химия, тотальный высокоэффективный
скрининг, виртуальный и реальный скрининг, молекулярное моделирование, генная
инженерия [192, 193]. В связи с этим, нами совместно с группой синтетиков
(руководитель профессор, д. фарм. н. С.И. Коваленко) была сформирована
виртуальная библиотека, систематизированная с помощью пакета ISIS 2.4. Для
обработки библиотеки и отбора структур – лидеров использовалась компьютерная
программа PASS C&T (Prediction of Activity for Substanses: Complex and
Training). Биологическая активность по программе PASS C&T оценивали
качественным образом (да/нет). В результате прогноза, кроме выявленной
активности, проводилась вероятность каждого вида действия (размерность от 0 до
1). Кроме того, учитывались фармакологические виды активности, вероятность
которых превышала 50% (Pa › 0,500) [196-198].
Учитывая то обстоятельство, что в патогенезе стресса лежит гиперпродукция АФК,
которые способны вызвать необратимые нарушения в нейроиммуноэндокринных
взаимодействиях, нами проведены исследования антиоксидантной, антирадикальной и
антиамнестической активности производных (4-оксо-4Н-хиназолин-3-ил)-алкил
(арил) карбоновых, отобранных по программе PASS (кафедра фармацевтической химии
Запорожского государственного медицинского университета, заведующий док. фарм.
н., профессор Мазур И.А.) в опытах in vitro и in vivo.
В основе разнообразных методов in vitro заложен механизм инициирования СРО
[199, 200]. Данные методы позволяют провести отсев значительного количества
веществ и отобрать соединения – кандидаты с высокой антиоксидантной (АОА) и
антирадикальной (АРА) активностью. Опыты in vivo позволят нам отобрать
соединения- кандидаты, которые обладают одновременно высокой и антиоксидантной
и антиамнестической активностью.
Отобранные нами соединения- кандидаты, в дальнейшем оценивались в условиях
моделирования острого иммобилизационного стресса по влиянию на процессы СРО,
состояние АО- системы в тканях головного мозга, способности к запоминанию и
обучению. Вещества на модели ОИС сравнивались с такими фармакологическими
стандартами как эмоксипин, тиотриазолин, ноофен, семакс.
Наиболее активное вещество (соединение - лидер) исследовалось на модели
хронического иммобилизационного стресса (ХИС), где учитывалась его способность
влиять на интенсивность СРО, активацию АО- системы, нормализацию показателей
углеводно - энергетического обмена, состояние ГАМК - эргической системы,
экспрессию генов раннего реагирования c-fos и антиапоптического белка bcl-2
влияние на морфофункциональное состояние нейронов CA1 зоны гиппокампа.
2.2. Объекты и методы исследования
Экспериментальная часть выполнена на 600 половозрелых белых крысах самцах,
массой 200- 250 г. Крысы получены из питомника Института фармакологии и
токсикологии АМН Украины. Животные содержались на стандартном рационе питания,
при естественной смене дня и ночи. Все экспериментальные процедуры осуществляли
в соответствии с «Положением об использовании животных в биомедицинских
исследованиях» [201].
Наиболее пригодными для изучения стресспротективного действия
фармакологических средств является легко воссоздаваемая классическая модель
острого иммобилизационного стресса (ОИС), которая характеризуется умеренной
интенсивностью стрессогенного влияния и стандартностью, а также отвечает
условиям гуманного отношения к лабораторным животным и их использованию в
эксперименте. Модель хронического иммобилизационного стресса была нами
использована на завершающем этапе расширенного исследования соединения- лидера
[202].
Перед моделированием стресса применяли пищевую депривацию, не ограничивая
животных в воде. Эксперименты проводили с учетом циркадных биоритмов. При
воспроизведении хронического стресса, ежедневное влияние раздражителя
приходилось на определенное время суток.
ОИС вызывали жесткой атравматической фиксацией на спине. Продолжительность
иммобилизации- 3 часа. Исследования поведенческих реакций у стрессированных
животных (ОИР, УРПИ) проводили через 3 часа после завершения действия
стрессорного фактора. После исследования поведенческих реакций крыс выводили из
эксперимента декапитацией под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг). У животных
извлекали головной мозг для биохимических, гистоиммунохимических и
морфометрических исследований [202].
ХИС воссоздавали в течении 18 суток. Ежедневная продолжительность воздействия
раздражителя (фиксация на спине)- 3 часа. Стадия тревоги при ХИС имеет место в
первые 4 суток, с 5 по 14-е сутки регистрируется стадия резистентности, после
15 суток- стадия истощения. На 18 сутки стрессирования проводилось исследование
стресспротективного действия препаратов по выше приведенной схеме [202]. О
выраженности хронического стресса судили по коэффициенту массы надпочечников,
тимуса, а также по ульцерогенному действию на слизистую оболочку желудка
[202].
2.3.
- Київ+380960830922