РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єкти досліджень та умови проведення експерименту
Експериментальні дослідження виконані на 42 статевозрілих білих щурах-самцях
масою 200-250 г. Позаяк показники імунної системи змінюються залежно від пори
року, дослідження проводили в осінньо-зимовий період. Експериментальні
втручання та евтаназія тварин проводилась із дотриманням міжнародних принципів
Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для
експериментальних наукових досліджень (Страсбург, 1985), ухвали Першого
національного конгресу з біоетики (Київ, 2000). Комісією з питань біоетики
Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького
(протокол № 8 від 15.12.2004р.) порушень вимог не виявлено. Модель хронічного
гіперімунокомплексного синдрому створювали за допомогою класичної моделі C.
Cohrane та D. Kofler у модифікації R. Williams [224] та посилаючись на праці
попередніх досліджень Чоп’як В. В. [188].
Усі експериментальні тварини були поділені на 2 серії:
І серія – інтактні тварини, яким вводили в хвостову вену кожні 7 днів впродовж
12 тижнів фізіологічний розчин (20 тварин);
ІІ серія – тварини з викликаним хронічним гіперімунокомплексним синдромом, яким
у хвостову вену кожні 7 днів впродовж 12 тижнів вводили бичачий сироватковий
альбумін із розрахунку 100мг/кг впродовж 12 тижнів (22 тварин).
Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації. Кров для виділення нейтрофільних
гранулоцитів забирали на гепарині (50 од. мл). Отримання клітин нейтрофілів,
моноцитів проводили із застосуванням розчинів фікол-урографіну з густиною 1,077
г/мл та 1,095 г/мл. Виділені клітини використовували для проведення відповідних
досліджень.
Для отримання сироватки крові периферичну кров витримували впродовж 1 год. в
термостаті при температурі 370С та 1 год. при температурі +40С. Сироватку крові
відбирали після центрифугування крові при 1500 об/хв. 10 хв.
Клінічні дослідження були проведені 2002-2007 роках у Львівському регіональному
медичному центрі клінічної імунології та алергології, а також у Львівській
обласній клінічній лікарні на базі ревматологічного відділення: було обстежено
150 хворих на хламідійну інфекцію, з них 82 жінки та 68 чоловіків у віці 18 –
50 років. Діагноз хламідійної інфекції виставлявся на основі міжнародних
критеріїв діагностики урогенітальних хламідіозів, офтальмологічних хламідіозів,
реактивних артритів хламідійного ґенезу, хламідійних бронхітів, бронхіальної
астми, неревматичних вад серця та хвороба Рейтера хламідійного ґенезу [39, 41,
58, 151, 173]. Серед них 39 хворих мали прояви імунодефіциту згідно протоколу
ВООЗ (1998). Клінічними ознаками імунодефіциту були часті рецидиви інфекції
(більше 4 разів на рік), атиповий перебіг, не ефективність етіотропної
антибактеріальної терапії, навіть при застосуванні комбінованих та супресивних
схем, стійке порушення функції органа-мішені, тривалий субфібрилітет, синдром
хронічної втоми, змішані опортуністичні інфекції (грибкові, герпетичні) [76,
98, 136].
Урогенітальний хламідіоз був верифікований у 56 хворих на хламідійну інфекцію,
а з проявами імунодефіциту – 14 хворих з цією групи. Реактивний артрит
хламідійного генезу був встановлений у 46 хворих з них 8 мали ознаки
імунодефіциту. У 11 хворих був встановлений кератокон’юктивіт хламідійного
генезу. Пневмонія, бронхіт, бронхіальна астма хламідійного генезу були
діагностовані у 14-ти хворих 6 з яких були з проявами імунодефіциту.
Неревматичні вади серця хламідійного генезу були встановлені у 12-ти хворих.
Хвороба Рейтера була діагностована у 11-ти хворих.
При обстежені хворих на хламідійну інфекцію враховувались у них формування
імунокомплексного синдрому, що могло в подальшому впливати на розвиток
автоімунних ускладнень.
Їх обстеження проводилося з урахуванням циркадного та сезоних ритмів.
Контрольну групу складали – 31 практично здорових людей у віці 18-ти - 40-ка
років, 16 жінок і 15 чоловіків.
В досліджуваній роботі були виділені наступні групи хворі на хламідійну
інфекцію 150 чоловік, серед них жінки (82) та чоловіки (68) у віці до 35-ти
років - 57, 35 і більше років – 93 обстежених, з гіперімунокомплексним
синдромом – 55, без нього – 95, з проявами імунодефіциту – 39, серед них 19
жінок і 20 чоловіків у віці до 35-ти років – 22, 35 і більше – 17 з хворобою
Рейтера – 11.
Методи дослідження
Оцінку гіперімунокомплексного синдрому здійснювали на основі вмісту циркулюючих
імунних комплексів та загальної комплементарної активністі сироватки крові. Для
оцінки нейтрофільного статусу проводили визначення їх фагоцитарної активності,
а також окисно-відновних ферментативних процесів. Метаболізм оксиду азоту в
нейтрофілах, моноцитах та сироватці крові щурів досліджували в кількох
аспектах: оцінювали рівень синтезу NO шляхом визначення активності ферментів
індуцибельної і конститутивної NO-синтаз; оцінювали пул NO за вмістом його
кінцевих метаболітів – нітрит- і нітрат-аніонів; Окрім того, морфологічний стан
і резервні можливості поліморфноядерні лейкоцити та мононуклеарних фагоцитів
оцінювали за допомогою методу електронної мікроскопії.
Дослідження активності ферментів NO-синтаз, вмісту нітрит- і нітрат-аніонів
виконано в Інституті біохімії ім. В.О. Палладіна спільно із к.б.н, ст.н.сп.
Коцюрубою А. В., за що складаю свою вдячність. Електронно-мікроскопічні
дослідження проведено у лабораторії електронної мікроскопії Львівського
національного медичного університету ім. Данила Галицького спільно із к.б.н.
Ковалишином В. І., за що висловлюю щиру подяку за допомогу при виконанні
досліджень. Клінічні імунологічні дослідження виконані на базі імунологічни
- Київ+380960830922