РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
При виконанні цієї роботи ми використовували комплекс мікологічних,
мікробіологічних, фізіолого-біохімічних, електронно-мікроскопічних і
статистичних методів досліджень. Більшість застосованих у роботі методів є
загальноприйнятими при роботі з чистими культурами патогенних і непатогенних
мікроорганізмів, у тому числі й міцеліальних грибів [4, 9, 50, 51, 52, 65].
Методи, застосовувані при проведенні скринінгу культур і визначенні деяких
параметрів, наводимо у цьому розділі.
2.1. Об’єкти дослідження
Об’єктом досліджень були чисті культури 30 штамів 11 видів із родини
Morchellaceae різного географічного походження (табл. 2.1), які зберігаються у
Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН
України (ІБК) [13].
Таблиця 2.1
Список досліджених штамів видів родини Morchellaceae
№ п/п
Вид гриба
Номер штаму в колекції ІБК
Рік виділення культури з природного матеріалу і країна, з якої походить
матеріал
Disciotis venosa (Pers.) Bond.
1741
1994, Німеччина *
Morchella angusticeps Peck.
1833
2002, Індія •
M. conica Pers.
1737
1991, Німеччина *
1738
1993, Ізраїль *
Продовження табл. 2.1
5
M. conica
1739
1993, Ізраїль *
1835
2004, Німеччина •
M. crassipes (Vent.) Pers.
1834
2004, Німеччина •
1851
2005, Німеччина •
1852
2005, Німеччина •
10
M. elata Fr.
1891
2006, Україна
11
M. esculenta (L.) Pers.
1744
1987, Франція *
12
1746
1987, Франція *
13
1747
1987, Франція *
14
1748
1987, Франція *
15
1749
2000, США *
16
1750
1990, Франція *
17
1753
1987, Франція *
18
1755
1990, Франція *
19
1805
2003, США **
20
1820
2003, США **
21
1843
2005, Україна
22
1844
2004, Україна
23
M. semilibera DC.
1740
2000, Німеччина *
24
1846
2005, Україна
25
M. spongiola Boud.
1837
2004, Франція •
26
1838
2004, Франція •
27
1850
2004, Франція •
28
M. steppicola Zer.
1849
2005, Україна ***
29
Verpa bohemica (Krombh.) J. Schцt.
1845
2004, Україна
Продовження табл. 2.1
30
V. conica (O.F. Mьll.) Sw.
1839
2003, Німеччина •
Примітки:
«*» – культури з Колекції проф. Ф. Баскота (Університет ім.
Ф. Шилера м. Ієна, Німеччина).
2. «**» – культури з Колекції П. Стаметса (США).
3. «***» – культури з Колекції Донецького державного університету,
одержані від д.б.н., проф. М.М. Сухомлин (Україна).
4. «•» – культури, ізольовані дисертантом зі спорового матеріалу,
одержаного від Х. Кельнера (Університет м. Лейпциг, Німеччина).
2.2. Отримання чистих культур із природного матеріалу
Виділення міцеліальних культур видів родів Morchella і Verpa проводили методом
пророщування аскоспор за описаною в літературі методикою [116]. Плодові тіла
морелевих грибів збирали в період їх масового плодоношення, відбирали
найстигліші, неінфіковані аскокарпи. Кожне плодове тіло розміщували окремо в
поліетиленовий або паперовий пакет. З плодового тіла за допомогою пензлика
видаляли рослинні рештки та частинки ґрунту, швидко обтирали ватою, змоченою
70%-м розчином етанолу, ніжку відрізали повністю. Шапинку гриба розрізали
навпіл та вміщували у стерильну чашку Петрі у такий спосіб, щоб аскоспори
вивільнялись на дно чашки. Швидкому відділенню аскоспор сприяла температура
25–26 °С і сонячне світло. За цих умов спори із сумок вивільнялись через кілька
годин. Після висипання спорового порошку плодове тіло стерильно видаляли з
чашки Петрі. Відомо, що в закритих чашках спорові відбитки можуть зберігатись
протягом кількох років за температури 20–22 °С.
Для пророщування аскоспор однорідну спорову суспензію, яку готували методом
розбавлень і контролювали в камері Горяєва, висівали на агаризоване середовище
– СА та ГПДА. Для пригнічення росту бактерій додавали антибіотики – 200 Од.
пеніциліну та 100 Од. стрептоміцину в 1 мл живильного середовища [9]. На цих
середовищах аскоспори проростали протягом доби без внесення будь-яких
додаткових стимуляторів. Чашки Петрі із спорами інкубували у термостаті при 26
єС до утворення багатоспорової культури. Далі проводили 2–3 пасажі на СА з
антибіотиком, і культуру переносили у пробірки на СА для зберігання в колекції
й подальших досліджень. Відсутність сторонньої мікрофлори, особливості
морфології колонії та міцелію контролювали як візуально, так і під
мікроскопом.
2.3. Методи лабораторних досліджень
2.3.1. Культивування на агаризованих живильних середовищах і субстратах
Ріст і морфологію чистих культур представників родини Morchellaceae
досліджували на агаризованих живильних середовищах різного складу. Культури
інкубували за температури 26 ± 1 єС. Для дослідження росту культурального
міцелію, його радіальної швидкості та морфологічних особливостей застосовували
живильні середовища такого складу:
агаризоване пивне сусло (СА): пивне сусло, сахаристість 8є по Балінгом – 1 л,
агар-агар – 20 г [9];
мальц-екстракт агар (МЕА, “DIFCO”);
картопляно-декстрозний агар (КДА, ”DIFCO”);
агар Чапека (ЧА), г/л: сахароза – 30,0; натрій азотнокислий (NaNO3) – 2,0;
калій фосфорнокислий однозаміщений (KH2PO4) – 1,0; магній сірчанокислий
(MgSO4·7H2O) – 0,5; залізо сірчанокисле (FeSO4 ·7H2O) – 0,01; калій хлористий
(KCl) – 0,5; агар-агар – 20,0 [52];
компостний агар (КА), г/л: сухий подрібнений компост – 76, агар-агар – 20;
вівсяно-мальц-дріжджевий агар (ВМДА) [267];
глюкозо-пептон-дріжджевий агар (ГПДА), г/л: глюкоза – 5,0; пептон – 2,5;
дріжджовий екстракт – 0,5; агар-агар – 20 [210].
Кислотність середовищ доводили до значення рН 6,5 за допомогою розчинів 1н КОН
і 1 н НСl.
Культурально-морфологічні дослідження проводили на чашках
- Київ+380960830922