Раздел 2
методы и объекты исследований
2.1. Методы исследования
2.1.1. Спектрофотометрические исследования.
Исследования проводились методом абсорбционной спектрофотометрии в видимой и УФ
областях спектра. Использовался метод спектрофотометрического титрования
раствора окрашенного БАВ постоянной концентрации раствором смеси окрашенный
лиганд – НК или окрашенный лиганд – НК – конкурирующий лиганд. Спектры,
полученные в результате титрования, налагались друг на друга для нахождения
точек их пересечения (изобестических точек). Существование одной или более
таких точек может свидетельствовать о присутствии в растворе как минимум двух
по-разному поглощающих компонентов, в которых соотношение лиганд1 : лиганд2 или
лиганд : НК различно [145]. Величины P/D рассчитывались как отношение общей
концентрации ДНК (CP) к концентрации лиганда (CD). Спектры поглощения смесей
БАВ – НК нормировали на концентрацию БАВ, a в случае тройных смесей БАВ1 – НК –
БАВ2 – на концентрацию поглощающего в видимой области лиганда. В случае тройных
смесей БАВ1 – НК – БАВ2 с двумя поглощающими в видимой области БАВ спектры
приводили в единицах поглощения без нормировки на концентрацию.
При определении концентрации тимусной ДНК (CP, в молях фосфатов), этидиума
бромида и Хоехста 33258 использовали значения молярных коэффициентов экстинкции
в максимумах поглощения: для ДНК e260 = 6,4ґ103 М-1 см-1 [146], для ЭБ e480 =
5,85ґ103 М-1 см-1 [147] и ХТ e338 = 4,2ґ104 М-1 см-1 [148], соответственно.
Концентрации нуклеозидов, кофеина и теофилина определяли весовым методом. При
определении концентрации ActII использовали значение молярного коэффициента
экстинкции в изобестической точке e400 = 1,61ґ104 М-1 см-1 [149],
соответствующей мономер-димерному равновесию. Спектрофотометрические измерения
в видимой и УФ - областях проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического
пути 10 мм и 20 мм на спектрофотометре Specord M40 (Германия) в фосфатном
(2,5ґ10-2М KH2PO4, 2,5ґ10-2М Na2HPO4) буферном растворе с pH=6,86.
Исследования комплексообразования ActII с полирибоцитидиловой кислотой
(poly(C)) в отсутствие и в присутствии кофеина проводились в ацетатном (9ґ10-3М
CH3COOH; 5ґ10-3М CH3COONa, pH=4,45) и в фосфатном буферных растворах, в которых
poly(C) находится, соответственно, в двуспиральном и односпиральном состояниях
[150]. При определении концентрации poly(C) использовали молярный коэффициент
экстинкции e270 = 6,3ґ103 М-1 см-1 в нейтральном и e278 = 7,4ґ103 М-1 см-1 в
кислом растворах [151].
2.1.2. Термическая денатурация.
При анализе температурных зависимостей поглощения свободной poly(C) и ее смесей
с ActII и CAF использовали следующие выражения для гипохромного эффекта H (%):
H = (Amax – Amin)/Aminґ100% (2.1)
и доли расплетенных пар оснований ДНК:
1 – и = (A – Amin)/(Amax – Amin) (2.2),
где и – степень спиральности матрицы, Amax, Amin, А – максимальное, минимальное
и текущее поглощения раствора при каждой исследованной температуре,
соответственно.
2.1.3. Количественный анализ спектров поглощения смесей.
Количественный анализ спектров поглощения смесей БАВ1 – ДНК – БАВ2 проводился
путем оптимизации методом наименьших квадратов разности между наблюдаемыми
значениями поглощений смесей Aij0 и расчетными значениями Aij, получаемыми по
уравнению Бугера-Ламберта-Бера: , где ejk – молярный коэффициент экстинкции
k-ого компонента смеси в j-й длине волны, Cki - концентрация соответствующего
компонента в каждой i-ой смеси. Для расчета равновесного состава (Cki) смесей и
термодинамических параметров комплексообразования при взаимодействии БАВ1 –
БАВ2 и БАВ — НК использовали следующие модели:
(1) В системах, в которых процессы комплексообразования описываются
классическими уравнениями закона действующих масс (ЗДМ), расчет равновесного
состава смесей и соответствующих констант комплексообразования проводился
методом Ньютона – Равсона с использованием оригинального варианта программы
DALS, предложенной Хартли и др. [145]. В том числе с помощью этой программы
определяли константы димеризации ActII – ActV и константы образования
гетероассоциатов Act и ЭБ с кофеином и теофиллином. Также с помощью этой
программы определяли соответствующие оптимальные величины молярных
коэффициентов экстинкции мономерной (em), димерной (ed) форм БАВ и комплексов
ActII – Tph, Act – CAF и ЭБ – Tph.
(2) При численном анализе спектральных параметров комплексов в системах БАВ1 –
ДНК – БАВ2 нами была разработана серия программ оптимизации, позволяющая
описывать взаимодействие БАВ с полиэлектролитами в случае, когда ЗДМ не
выполняется. Для расчетов параметров комплексообразования в системах ActIII –
ДНК и ActII – poly(C) в отсутствии и в присутствии CAF были составлены
программы оптимизации DALSMOD и DALSCOMP [152]. Для расчетов параметров
комплексообразования в системах ЕВ – ДНК в отсутствие и в присутствии
нуклеозидов и Tph были использованы программы оптимизации COMP и COMPHET [153,
154]. В этих программах, полученных на основе оригинальной программы DALS,
расчет параметров связывания лигандов с НК проводился по соответствующим
уравнениям, описывающим процессы конкурентного связывания лигандов на
полиэлектролитных матрицах вместо алгоритма расчета параметров по простым
уравнениям ЗДМ. Эти уравнения детально рассматриваются в соответствующих главах
диссертации.
Оптимальные значения молярных коэффициентов экстинкции образующихся комплексов
(eij) и соответствующие константы связывания вычислялись также в описанных выше
программах оптимизации одновременно для всех смесей в широком интервале длин
волн по закону Бугера – Ламберта – Бера. Оптимизи
- Київ+380960830922