РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Експериментальні тварини
У роботі були використані такі тварини: бики, кролі, морські свинки, щурі,
безпорідні і лінійні миші СВА, C57BL/6, BALB/C, C3H/Hej, гібриди:
(СВАґС57BL/6)F1, (С57BL/6ґA/Sn)F1, безтимусні миші nude.
Дослідження проводились на биках 1 річного віку вагою 150-200 кг, кролях вагою
1,5-2,0 кг в дослідному господарстві Національного аграрного університету,
також проводили дослідження на нелінійних морських свинках вагою 200-250 г і
лінійних мишах вагою 18-20 г, отриманих з віварію НДІ експериментальної
онкології, патології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ та з розплідника
“Столбовая”, (Москва), безтимусних мишах nude з онкологічного наукового центру
РАМН. Щурів лінії Wistar вагою 150-200 г отримували з віварію НДІ
ендокрінології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМНУ. Тварини
утримувались в стандартних умовах віварію. Опромінені миші та щурі утримувались
в спеціальних умовах.
2.2. Культура мікроорганізмів та антигени
В експериментальних дослідженнях використовували Staphylococcus aureus штами
Wood-46 (2351), Cowan-1 (2352), 3272, отримані з Чехословацької колекції
мікроорганізмів, Staphylococcus aureus 209, Candida albicans, Esсherihia coli,
Micrococcus lisodeicticus, отримані з музею культур кафедри мікробіології та
загальної імунології Київського національного університету імені Тараса
Шевченка. Стафілококовий анатоксин (СА), дифтерійний анатоксин (ДА),
дифтерійно-правцевий анатоксин (ДПА) виробництва НДІ епідеміології та
мікробіології ім. М.Ф. Гамалеї РАМН (Москва), РРD Mycobacterium tuberculosis.
Антигени Rota virus та Нью-Кастл надані НАН України.
Staphylococcus aureus Cowan-1 (2352), що містить білок А і є стандартним
штамом-продуцентом його, та Staphylococcus aureus Wood-46 (2351), який не
містить білок А, вирощували на МПА, покритому харчовим целофаном. Для
накопичення білка А стафілокок штаму Cowan-1 вирощували на поживних середовищах
з додаванням крові або сироватки та інших інгредієнтів при 37°С протягом 24
годин [282]. Культуру Escherichia coli вирощували на МПА при 37°С протягом
18-24 годин. Candida albicans - на сусло-агарі при 28°С 18-24 години. Клітини
відмивали фізіологічним розчином, інактивували 1% розчином формаліну, звільняли
від консерванту та зберігали в замороженому стані. В ряді експериментів
застосовували стафілокок живий або інактивований прогріванням при 85-90°С 30
хв. на водяній бані. В дослідах використовували корпускулярний антиген (КАС) в
концентрації 106-109 клітин/мл.
Різні форми білка А та клітинно-зв’язаний білок А (КЗБА) отримано нами.
В дослідах використовували пептидоглікан стафілокока (ПГ), отриманий в
лабораторії мікробіологічних та імунологічних проблем біотехнології при кафедрі
мікробіології та загальної імунології проф. Позуром В.К. [283].
2.3. Визначення впливу різних чинників на продукцію та активність білка А,
факторів патогенності стафілокока
З метою оцінки впливу різних чинників на продукцію та активність білка А,
факторів патогенності стафілокока мікроорганізми вирощували на поживних
середовищах з різним вмістом глюкози, свіжої дефібринованої крові, сироватки
крові, NaCl, екстрактів дріжджів, яєчного жовтка і ін. Використовували і
фізичні фактори - обробку ультразвуком та електромагнітним випромінюванням
мм-діапазону (КХЧ) [284-286].
В дослідах застосовували прилад "Явь-1" (ІРЕ РАН, Москва). Опромінення
здійснювали при довжинах хвиль: 4,9 мм, 5,6 мм, 7,1 мм (діапазон частот 43-65
ГГц) електромагнітним випромінюванням нетеплової інтенсивності 1-10,0 мВт/см2.
В роботі використовували штами: Staphylococcus aureus Cowan-1, Wood-46, 3272,
209, а також Micrococcus lysodeicticus. З добової культури вказаних штамів
стафілокока готували суспензії в 0,15 М розчині хлориду натрію в концентрації
1ґ109 клітин/мл та опромінювали КХЧ послідовно зі збільшенням експозиції: 1
день - 20 хв., 2 день - 30 хв., 3 день - 40 хв., 4 день - 50 хв., 5 день - 60
хв. Опромінені культури мікроорганізмів висівали на поживні середовища та
визначали їх біологічні властивості.
Визначення морфологічних та тинкторіальних властивостей. На знежирених
предметних скельцях готували мазки культур стафілокока до опромінення та після
встановленого режиму опромінення. Препарати фарбували за методом Грама [287,
288]. Проводили світлопольну імерсійну мікроскопію з об’єктивом 90ґ.
Визначення культуральних властивостей та пігментоутворення стафілокока.
Визначення культуральних властивостей та пігментоутворення стафілокока
здійснювали, як описано [5, 287, 288]. Культури висівали на МПБ та МПА та
вивчали їх культуральні властивості. Пігментоутворення досліджували при посіві
на жовточно-сольовий агар (ЖСА) та інкубації при 37°С протягом доби, надалі
культури витримували при кімнатній температурі на світлі протягом 48 годин.
Визначення плазмокоагулюючої здатності. У кроля брали кров із серця і змішували
з антикоагулянтом (5% розчин щавелекислого калію або лимоннокислого натрію) у
співвідношенні 1:4. Плазму відокремлювали від форменних елементів крові шляхом
центрифугування, розводили 0,15 М розчином хлориду натрію у співвідношенні 1:4
та розливали в стерильні агглютинаційні пробірки по 0,5 мл. В кожну пробірку,
за виключенням контрольної, вносили по 0,2 мл клітинної суспензії досліджуваних
культур стафілокока. Інкубували при 37°С, облік проводили через кожні півгодини
на протязі 18 годин [5].
Визначення лізоциму. Для визначення лізоцимної активності використовували метод
чашок [287, 288]. В якості тест-мікроорганізму використовували живу культуру
Micrococcus lysodeicticus. До розплавленого та охоло
- Київ+380960830922