РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Групування дослідів
Для вирішення поставлених у роботі завдань були проведені експериментальні дослідження на 104 самцях щурів лінії Вістар віком 6-7 місяців, з масою тіла 250 - 300 г.; на 12 самцях мишей лінії BALB/c, віком 20 тижнів, масою 20 г та мононуклеарах периферійної крові людини.
Лабораторних тварин утримували в умовах віварію Української медичної стоматологічної академії на стаціонарному раціоні харчування у відповідності зі "Стандартными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)". Всі маніпуляції з тваринами проводились за дозволом Комісії з етичних питань та біоетики ВДНЗУ "УМСА" (протокол №15 від 22.03.2004).
З метою вивчення in vivo впливу гістаміну на процеси апоптозу лімфоїдних клітин щурів (лімфоцитів, тимоцитів, спленоцитів, мононуклеарів периферійної крові) були використані гістамін, селективні блокатори гістамінових рецепторів (HR1, HR2 та HR3) та експериментальна модель бронхіальної астми. Для досягнення поставлених у роботі задач тварини були розподілені на наступні серії дослідів.
І серія - дослідження базального рівня апоптозу лімфоїдних клітин у здорових щурів та рівня апоптозу після застосування гістаміну та селективних блокаторів гістамінових рецепторів HR1 та HR2 : 1 група - інтактні щури (n = 10); 2 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин після введення гістаміну щурам (n = 10); 3 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин після введення селективного блокатору гістамінових рецепторів HR1: мінімальної дози (n = 6), середньої (n = 6) та максимальної дози (n = 6); 4 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин після введення селективного блокатору гістамінових рецепторів HR2 - мінімальної дози (n = 6), середньої (n = 6) та максимальної дози (n = 6).
ІІ серія - дослідження впливу HR3-блокатора на рівень апоптозу лімфоїдних клітин: 1 - в експерименті in vivo на мишах : а) інтактні миші (n = 6), б) піддослідні (n = 6); 2 - в експерименті in vitro на мононуклеарах периферійної крові людини.
ІІІ серія - дослідження рівню апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення та введеня селективних блокаторів гістамінових рецепторів HR1 та HR2: 1 група - дослідження рівню апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення (n = 10); 2 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення та введення селективного блокатору гістамінових рецепторів HR1 тваринам (n = 10); 3 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення та введення селективного блокатору гістамінових рецепторів HR2 тваринам (n = 10).
Дію гістаміну визначали шляхом введення гістаміну дигідрохлориду (Sigma, США) в дозах 0,001, 0,01 та 0,1 мкг/кг маси тіла щурам підшкірно з інтервалом 24 години протягом 1, 5 та 10 днів. В якості блокатору H1R було застосовано дезлоратадин ("Еріус", Шерінг-Плау, США) в дозах 0,007 мг/кг, 0,07 мг/кг та 0,7 мг/кг маси тіла протягом 10 днів [107]. В якості блокатору H2R був використаний фамотидін (КМП, Україна) в дозах 0,06 мг/кг, 0,6 мг/кг та 6 мг/кг маси тіла протягом 10 днів [119]. Блокатори HR вводили перорально з інтервалом 24 години. Дози препаратів підбирались на основі середньотерапевтичних доз у перерахунку на 1 кг маси тіла [107,125].
Дію блокатора НR3 визначали шляхом введення тіопераміду ("Thioperamide maleate", Sigma-RBI, Germany) мишам в дозі 10 мг/кг маси тіла (n=6) інтраперітонеально протягом 10 днів [126].
Для експерименту in vitro використовували суспензію лімфоцитів, яку отримували з периферійної гепаринізованої венозної крові здорової людини шляхом центрифугування в одноступеневому градієнті щільності фікол-верографіні (1,077 г/мл). Лімфоцити у кінцевій концентрації 106/мл інкубували у середовищі Ігла з глютаміном (Sigma, США), 10% інактивованою телячою сироваткою ("Bio Mark Inc", Львів, Україна), 100 мкг/мл гентаміцином сульфат (ГНЦЛС, Україна) при 370С з тіоперамідом в концентраціях 1 µM, 10 µM та 100 µM в двох паралелях 24, 48 та 72 год. [127].
Для дослідження апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення у піддослідних щурів була відтворена експериментальна модель бронхіальної астми. Щури були сенсибілізовані внутрішньобрюшинним введенням 0,5мг овальбуміну/10 мг гідроокису алюмінію (CSL, Parkville, Australia) в 0,9% стерильному фізіологічному розчині. На 12, 14, 16, та 18 день всі групи були аероалергізовані овальбуміном в дозі 10 мг/мл в об'ємі 700 см3 з діаметром часточок аерозолю 10 мкм при максимальному розпиленні рідини 0,4 мл/хв протягом 15 хв 3 рази з інтервалом 30 хв. за допомогою інгалятора ультразвукового "Муссон-2" (ФГУП "Алмаз", г. Ростов-на-Дону, Россия). Через 24 години після останнього впливу аерозолю у щурів спостерігались ознаки бронхіальної астми [128,129].
У експериментальних тварин після забою під тіопенталовим наркозом забирали тимус, селезінку, периферичні лімфатичні вузли та кров з правого шлуночка серця з подальшим отриманням суспензії клітин за стандартними методиками [130] та проведенням морфологічних та імунологічних досліджень.
З метою вивчення впливу гістаміну на апоптоз лімфоїдних клітин (лімфоцитів, тимоцитів, спленоцитів, мононуклеарів периферійної крові) шляхом застосування гістаміну та селективних блокаторів гістамінових рецепторів (HR1, HR2 та HR3) за фізіологічних умов та при алергічному запаленні нами були проведені дослідження в модельних дослідах, що узагальнені в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Схема експериментальних досліджень
№ серії№
гру-пиЕкспериментальна модельПрепарати, дози, тривалість та спосіб застосування1234І1Дослідження базального рівня апоптозу ЛК (Л, Т, С та МНПК) за фізіологічних умов у здорових щурів
(n = 10)2Дослідження рівня апоптозу ЛК (Л, Т, С та МНПК) щурів після застосування гістаміну в експерименті in vivo
(n = 10) Гістамін дигідрохлорид
0,1 мкг/кг маси тіла,
5 днів, підшкірно3Дослідження рівня апоп
- Київ+380960830922