РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Клінічні дослідження пацієнток всіх груп містили в собі вивчення антропометричних даних; відносні значення жирового, кісткового і м'язового компонентів; індекс маси тіла і конституційний тип.
З метою діагностики вірусної інфекції (ЦМВ і РГІ) використовували метод імуноферментного аналізу (ІФА), полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та імунофлюоресцентної мікроскопії. Матеріалом для дослідження служили: венозна кров, слиз цервікального каналу, січа та слина.
Метод імуноферментного аналізу:
У якості лабораторної діагностики ЦМВ і РГІ використовували експрес метод з імуноферметною тест-системою та серологічні методи, які засновані на виявленні антигенів вірусу простого герпесу [10,36]. Дослідження по виявленню віруспецифічних антитіл у зразках сироваток здійснювали ІФА-тест-системою по виявленню антитіл до ЦМВ; ВПГ - 1 і ВПГ - 2. Постановку тесту здійснювали в 3 паралельних рядах, де один з них був сорбованим у лунках антигеном ЦМВ; ВПГ - 1 типу, по 2 ряду - антигеном ВПГ - 2 типу. Для контролю використовували клітинний субстрат, на якому вирощували вірус. Сироватки кожної пацієнтки досліджували в 3-разовому розчиненні, починаючи з розведення 1:100. Комплекс антиген-антитіло визначали за допомогою пероксидазного кін?югату проти глобулінів людини (Росія). Для виявлення вірусного антигену в якості антитіл для створення імуносорбенту використовували суміш АТ до ЦМВ; вірусу герпесу 1 та 2 серотипів. Дана модифікація дозволила з однаковою ефективністю уловлювати різні типи вірусу герпесу. У якості антитіл використовували такі ж антитіла, мічені пероксидазою. Облік здійснювали на спектрофотометрі при довжині хвилі 492 нм. ІФА дозволив визначити та, що особливо важливо, розмежувати специфічні антитіла класу Ig G (реконвалісцентні або анамнестичні) та IgМ ("гострі"), що відповідають свіжому зараженню або рецидиву хронічної РГІ, виявити вірусні антигени (ВГГ та ЦМВ) у сечі, слині та слизу цервікального каналу. До переваг даного методу відносять високу чутливість, специфічність, швидкість та простоту виконання.
Метод полімеразної ланцюгової реакції:
Діагностика ЦМВ та герпес-вірусної інфекції була здійснена на молекулярно-генетичному рівні методом ПЦР [87]. У основі реакції лежить ампліфікація in vitro, де використовуються дві олігонуклеотидних праймера (приманки), фланкіруючі ділянку ДНК специфічної для визначення збудника, процес ампліфікації полягає в циклах температурної денатурації ДНК, що повторюються, випалу праймерів з компліментарними послідовностями та наступною добудовою полінуклеотидних ланцюгів цієї ділянки ДНК з цих праймерів ДНК-полімерази. У результаті відбувається експоненціальне збільшення кількості специфічного фрагмента по формулі 2п, де п - це число минулих циклів ампліфікації. Надалі проводять електрофотометричний аналіз продуктів ПЦР в агарозному гелі. Обов?язково ставлять позитивний контроль із явно внесеною детектируємою нуклеїновою кислотою і негативний контроль. Пофарбовану етидум бромідом ДНК у гелі переглядають під УФО - випромінюванням при довжині хвилі 254 нм, по наявності специфічного фрагменту ампліфікації судять про присутність шуканої нуклеїнової кислоти в досліджуваному матеріалі. Метод ПЦР відноситься до високочутливої діагностики, він специфічний і час виконання складає декілька годин.
Мікроскопічна діагностика вірусної інфекції передбачала дослідження матеріалу, пофарбованого імуноглобулінами, що люмінісцюють, проти ЦМВ та вірусу простого герпесу типу 1 та 2 методом прямої імунофлюоресценції. Матеріалом для дослідження стали зскрібки епітелію в області заднього склепіння піхви, піхвової частини шийки матки та цервікального каналу. При наявності уражень шкіри в області вульви та промежини для дослідження проводилися мазки - відбитки з поверхні підозрілих на вірусне ураження ділянок. Діагностичну ефективність бактеріоскопічного методу оцінювали відносно до результатів мікроскопічного дослідження.
Відбір проб для мікробіологічного дослідження здійснювали з використанням правил асептики та антисептики. Матеріалом для мікробіологічних досліджень стали: вміст піхви, піхвові змиви, мазки та зскрібки зі слизової оболонки піхви, з цервікального каналу та уретри; зскрібки-відбитки зі стінок піхви, передверря піхви та малих статевих губів. Вміст піхви відбирали за допомогою стерильного одноразового шприца з приєднанням до нього стерильного підключичного катетеру одноразового застосування. Одержаний матеріал, у кількості 1 мл приміщували в пробірку, що містить транспортне середовище сКС-199, яку щільно закривали резиновою пробкою та впродовж 1,5-2 рік доставляли в лабораторію.
Мікроскопічні методи дослідження включали світову та люмінісцентну мікроскопію одержаного матеріалу. За допомогою світової мікроскопії досліджували вологі ("роздавлена" крапля) та пофарбовані препарати. Вологі препарати для виявлення рухомих трихомонад, псевдоміцелія грибів, мікроорганізмів роду Mobiluncus sp., ключових клітин та лейкоцитів готували шляхом ретельного переміщування краплі виділень з краплею 0,9% фізіологічного розчину. Ці препарати розглядали в декількох полях під збільшенням ? 400.
Для приготування пофарбованих препаратів нативний матеріал наносили щіткою або стерильним ватним тампоном на 3 знежирених предметних скла, які після підсушування на повітрі та фіксації фарбували: 1 - метіленовим синім, 2 - за Грамом та 3 - за Грамом у модифікації Kopeloff (для попередньої оцінки бактеріальної флори - грампозитивної, грамнегативної або варіабельної; паличкової, кокової або змішаної, наявність кандидозу; оцінювали ступінь вираженості фагоцитозу). Тип біоценозу піхви оцінювали за класифікацією Е.Ф.Кіри [90].
Для люмінісцентної мікроскопії нативний матеріал наносили щіткою, шпателем або ложечкою Фолькмана на 2 знежирених, промаркированих предметних скла, розділених на три сектори (1 - хламідії; 2 - мікоплазми та 3 - уреаплазми). На 1 скло зскрібний матеріал брали з цервікального канал
- Київ+380960830922