РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для вирішення поставлених завдань проведені серії експериментів in vitro та in vivo. У роботі використано 236 самців білих щурів з масою тіла 0,14-0,16 кг.
2.1. Характеристика експериментальних моделей, що використовува-лися в роботі
Спленектомію виконували за Стручко Г.Ю. [111]: за асептичних умов під тіопенталовим наркозом (40 мг/кг маси тіла) проводили сере-динну лапаротомію, перев'язували судини селезінки шовком і видаляли її. Евтаназію тварин проводили через 2 тижні під легким ефірним наркозом. Для стабілізації крові застосовували 3,8% розчин цитрату натрію (1:9).
Тимектомію виконували за Галкіним Ю.В., Добкіним В.Г. [37]. Після введення в тіопенталовий наркоз щурів у положенні на спині фіксували на операційному столі. Операційне поле обробляли 5% спиртовим розчином йоду. Поздовжну стернотомію здійснювали тупокінцевими очними ножи-цями. Тварину переводили на штучне дихання і фронтально видаляли ви-лочкову залозу. Повноту тимектомії оцінювали макроскопічно при розтині тварин після проведення основних серій дослідів.
Експериментальний дисбактеріоз моделювали внутрішньошлунко-вим введенням тетрацикліну в дозі 5 мг/кг маси тіла впродовж 7 днів [85] статевозрілим самцям білих щурів з масою тіла 0,15-0,18 кг, яких утриму-вали за стандартних умов віварію. Тварини відповідали 4 класу чистоти за мікробіологічним та паразитологічним статусом (відсутність специфічних мікроорганізмів Salmonella, Listeria, Yersinia, Mycobacterium, Streptobacil-lus, Leptospira, Erysipelotrix та ектопаразитів). Грамнегативну портальну або системну ендотоксинемію моделювали шляхом внутрішньоочеревин-ного або внутрішньовенного (в яремну вену) введення сальмонельозного ендотоксину (штам Salmonella typhimurium 1468 із колекції Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського) в дозі 10 мкг на кг маси за 4 і 2 год до декапітації щурів [27].
Для лікування дисбактеріозу та корекції порушень неспецифічної імунологічної реактивності використовували бактерійний препарат біфі-форм ("Ferrosan", Данія) та імуностимулятор спленін ("Дарница", Украї-на). Кожна капсула біфіформу містила 107 Bifidobacterium longum та Ente-rococcus faecium, що є активними компонентами бактерійного препарату, а також глюкозу, стеарат магнію, тальк і діоксид титану. Препарат признача-ли по одній капсулі, вміст якої одноразово вводили в шлунок металевим зондом щоденно впродовж 7 днів тваринам із сформованим дисбактеріо-зом кишечника. Спленін та білкову фракцію гомогенату селезінки, отрима-ну шляхом екстракції на мікроколонках C2 AmprepTM (Велика Британія), вводили протягом тижня внутрішньом'язово у дозі 0,5 мл/кг маси тіла.
2.2. Методи дослідження неспецифічної імунологічної реактивності
Дослідження вмісту цитокінів у сироватці крові проводили на імуно-ферментному аналізаторі "Униплан-М" (Росія) за допомогою наборів реа-гентів "РгоСоn IL-1?" для визначення ІЛ-1? (Росія) та "РгоСоn ТNF?" (OOO "Протеиновый контур", Росія) для визначення ФНП? .
Тканини внутрішніх органів (тимус, наднирники, серце, легені, пе-чінку, селезінку, нирку і тонку кишку) одразу після декапітації щурів замо-рожували в рідкому азоті. Наважки тканин органів гомогенізували в 2,0 мл боратного буферу (рН 9.0) і надалі використовували в біохімічному ана-лізі. Протеолітичну активність цитратної плазми крові і тканин внутріш-ніх органів визначали за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу ("Simko Ltd", Україна). Принцип методу полягає в тому, що при інкубації білкових азосполук у присутності активаторів та інгібіторів протеолізу, які містяться в плазмі крові і тканинах, відбувається лізис азоальбуміну (де-градація низькомолекулярних протеїнів), азоказеїну (протеоліз високомо-лекулярних білків) та азоколу (колагеноліз), інтенсивність якого оцінюєть-ся за ступенем забарвлення інкубаційного середовища.
Визначення сумарного, ферментативного і неферментативного фіб-ринолізу в плазмі крові і тканинах внутрішніх органів проводили за лізи-сом азофібрину ("Simko Ltd", Україна): при інкубації азофібрину із стан-дартною кількістю плазміногену в присутності активаторів та інгібіторів фібринолізу, які містяться в плазмі крові або в тканинах, утворюється плазмін, а інтенсивність фібринолізу оцінюється за ступенем забарвлення розчину в лужному середовищі в присутності ?-амінокапронової кислоти (неферментативний фібриноліз), або без неї (сумарна фібринолітична ак-тивність). Різниця між ними відповідає інтенсивності ферментативного фібринолізу [77]. Вміст малонового діальдегіду (МДА) у тканинах внут-рішніх органів визначали за методикою Стальної І.Д., Гаришвілі Т.Г.[110]. Для виділення нейтрофілів і макрофагів використовували пробірки "Vacu-tainer? CPTTM" фірми "BECTON DICKINSON" (США). Фагоцитарну ак-тивність та фагоцитарний індекс визначали за загальноприйнятими ме-тодами [58]. Окислювальний метаболізм нейтрофілів та моноцитів-макро-фагів визначали методом хемілюмінесценції (ХМЛ) [234]. Реєстрацію ХМЛ проводили на хемілюменометрі "ПХЛ-1" (Росія) в режимі накопи-чення при кількості нейтрофилів або моноцитів-макрофагів 2 ? 104 клі-тин/мл [31].
2.3. Мікробіологічні методи дослідження
Для дослідження порожнинної мікрофлори товстої кишки брали її відрізок довжиною 2-2,5 см, з якого пінцетом за стерильних умов витиску-вали вміст, зважуючи його на торсійній вазі. Наважку вносили в стерильну пробірку і додавали стерильний ізотонічний розчин хлориду натрію (1:10). Суміш ретельно розтирали скляною стерильною паличкою до утворення гомогенної маси. З гомогенату в подальшому готували ряд серійних деся-тикратних розведень (від 10-2 до 10-12) у стерильному ізотонічному розчині хлориду натрію. З кожної пробірки титраційного ряду стерильною мірною мікропіпеткою відбирали 0,1 мл суміші і виливали її на поверхню відпо-відного твердого живильного середовища. Після цього стерильним скля-ним шпателем ретельно розтирали краплю суміші по всій пов