РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Для досліджень використовувалась сироватка крові та сеча людини, а також зразки
крові курчат-бройлерів, баранів, щурів, кролів та котів. Аналіз рівню експресії
та мікрогетерогенності АГП проводили у 30 умовно здорових донорів (1 група),
137 хворих з гострим запаленням вірусного походження (2 група), 22 хворих з
гострим запаленням бактеріального походження (3 група), 16 хворих з пухлинами
панкреатодуоденальної зони (ПДЗ) (4 група) та 39 хворих з лейкеміями (5 група).
Середній вік досліджуваних та розподіл за особливостями перебігу патологічного
процесу наведено у таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Загальна характеристика досліджуваних груп
Група
n
Вік у роках
(M±m)
Здорові донори (1 група)
30
33,47±3,63
Гострі запалення вірусного генезу (2 група)
гострі вірусні гепатити (ГВГ)
хронічні вірусні гепатити (ХВГ)
ГВГ з фульмінантним перебігом
ГВГ з синдромом холестазу
137
105
13
13
30,34±1,13
40,08±1,27
22,67±0,34
28,92±1,02
Гострі запалення бактеріального генезу (3 група)
Сепсис
Пневмонії
22
16
54,27±1,08
43,35±0,88
Пухлини ПДЗ (4 група)
16
60,92±3,61
Проліферативні захворювання системи крові (5 група)
Хронічні лімфоїдні лейкемії (ХЛЛ)
Хронічна мієлоїдні лейкемії (ХМЛ)
Гострі лейкемії
Лімфоми
Мієломи
45
11
12
58,56±2,56
52,82±2,00
39,75±3,68
52,75±3,28
59,86±2,87
Зразки крові та сечі були люб’язно надані співробітниками кафедр гематології
(згідно договору про науково-технічне співробітництво з 01.07.2006 по 31.12.08)
та інфекційних хвороб Дніпропетровської державної медичної академії (згідно
договору про науково-технічне співробітництво від 4.12.06).
При проведенні біохімічних досліджень були використанні хімічно чисті реагенти
фірм Sigma (США), Serva (США), Amersham Pharmacia Biotech Limited (Швеція),
DAKO (Данія), Merk (Германія), Chemicon (США), Chemapol (Чеська республіка),
Лектинотест (Україна), СінБіас (Україна), Boehringer Mannheim (Germany).
2.2. Отримання моноспецифічних антитіл до б-кислого глікопротеїну
Антисироватку до АГП отримували імунізацією кролів препаратом білку фірми Sigma
(G9885-5MG) за вказаною на рис.2.1. схемою.
Рис.2.1 Схема імунізації кролів.
Кролів імунізували внутрішньошкірно в декілька точок спини по 20 мкг препарату
в рівному об'ємі повного ад'юванту Фрейнда тричі з інтервалом сім днів із
наступною реімунізацією через кожні чотири тижні. Кров відбирали з кінцевої
вушної вени у кількості 10-30 мл. Після ретракції згустку кров центрифугували
протягом 15 хв. при 3000 об./хв. До одержаної антисироватки додавали натрій
азид до кінцевої концентрації 0,1% [98]. Специфічність та титр антитіл у
одержаних антисироватках тестували за методами перехресного імуноелектрофорезу
та імуноблотингу [99].
Фракцію, збагачену імуноглобулінами G (IgG), одержували шляхом трикратного
висолювання сироватки амоній сульфатом до кінцевої концентрації 33% [98] і
подальшого діалізу осаду (3 рази по 6 годин) проти забуференого фізіологічного
розчину (ЗФР). Кількість білку у діалізаті визначали за методом Бредфорд,
доводили до кінцевої концентраціі 10?12 мг/мл і використовували для очистки
імуноголобулінів G, яку проводили шляхом афінної хроматографії на
протеїн-А-агарозі. Для цього 1 мл одержаної фракції наносили на колонку
розміром 0,7х2,5см, що заповнена протеїн-А-агарозою фірми Sigma (США). Білки,
що не зв’язались з протеїн-А-агарозою, віддаляли забуференим фізіологічним
розчином. Елюцію проводили 0,1М гліцин-НСl буферним розчином рH 2,8 з
послідуючою нейтралізацією 2М трис-НСl рН 9 у співвідношенні 1:10. Максимальна
швидкість елюції становила 0,28 мл/хв, об’єм фракцій – 1 мл. Оптичну густину
білку у фракціях вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 280 нм
(рис. 2.2).
Рис. 2.2. Профіль елюції фракцій, що отримані після хроматографії на
протеїн-А-агарозі.
Елюат тестували на наявність IgG методом імунодоту. Фракціі, що містили
максимальну кількість загального білку та IgG об’єднували, діалізували проти
ЗФР 3 рази по 8 годин та використовували для подальших досліджень.
2.3. Виділення б-кислого глікопротеїну з сироватки крові людини
2.3.1. Гідрофобне екстрагування. Виділення б-кислого глікопротеїну з сироватки
крові людини проводили шляхом гідрофобного екстрагування фенолом фірми Merk
(Германія) за методикою Chan, Yu [100]. На рис. 2.3. представлено основні етапи
цього процесу.
До сироватки в об'ємі 1 мл додавали 1 мл 0,1М трис-НСl рН 7,4 та 2 мл фенолу,
насиченого водою протягом ночі, та інкубували на водяній бані при 700С протягом
20 хвилин. Отриманий екстракт охолоджували на кризі 10 хвилин та центрифугували
протягом 10 хвилин при 8000 об/хв..
Рис.2.3 Схема отримання б-кислого глікопротеїну методом гідрофобного
екстрагування.
Для подальших досліджень використовували супернатант, який розливали на
аліквоти по 0,5 мл та зберігали при -300С не більше 30 днів.
2.3.2. Імуноафінна хроматографія на імуносорбенті. Принцип афінної
хроматографії полягає у здатності біополімерів специфічно оборотно
(нековалентно) взаємодіяти один з одним завдяки їх біологічним функціям або
структурі. Різновидом афінної хроматографії є метод імуноафінної хроматографії,
в основу якого покладено феномен взаємодії між антигеном та антитілом. До
нерозчинного неспецифічного компоненту – матриці за допомогою зшиваючого агенту
приєднують антитіла і, таким чином, отримують імуносорбент.
Для проведення імуноафінної хроматографії нами був отриманий імуносорбент з
імобілізованими антитілами до б-кислого глікопротеїну. В якості матриці
використову
- Київ+380960830922