ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Методы исследования
Обследовано 126 больных хронической ишемической болезнью сердца, в том числе 106 человек с различными нарушениями сердечного ритма и 20 практически здоровых человек - лица контрольной группы.
Диагноз ХИБС ставился на основании анамнеза заболевания, характерных жалоб больных, клинических данных, динамике электро- и эхокардиографических показателей.
Кровь для исследования брали утром, на следующий день после поступления больного в стационар и после курса терапии на 19-21-й день.
Определение концентрации натрийуретического гормона в плазме крови [171].
Производили забор 5 мл венозной крови в пробирки, содержащие 3-4 капли раствора гепарина, 1 мл которого содержит 5000 ЕД препарата. Отделяли плазму от эритроцитов путем центрифугирования при 3000 об/мин. в течение 5 мин. Добавляли к 2 мл полученной плазмы 100 мкл 50 %-ного раствора сульфосациловой кислоты, проводили тепловую обработку этой смеси при Т=100оС в течение 15 мин., затем центрифугировали и отбирали над осадочную жидкость, содержащую натрийуретический гормон, который обладает биохимическими свойствами гликозидов, в частности уабаина.
Приготовляли препарат Na-K-АТФазы по методу, описанному Э.Я. Карельсон и соавт. [60] из головного мозга крысы. Помещали приготовленный препарат Na-K-АТФазы в количестве 50 мкл в реакционную среду следующего состава: трис-HCl (pH 7,45) - 5, KCl -20, NaCl - 100, MgCl2.6H2O - 4,5 (конечная концентрация компонентов в мМ); температура реакционной среды - 37оС.
Распределяли реакционную смесь по 1 мл в 7 пробирок, причем в 5 пробирок добавляли по 50 мкл раствора уабаина различной концентрации: 1мМ, 0,1мМ, 0,01 мМ, 0,001мМ, 0,0001мМ, шестую пробирку принимали за эталонную и в седьмую пробирку добавляли 50 мкл плазмы, обработанной 50%-ным раствором сульфосациловой кислоты. Добавляли в каждую пробирку АТФ концентрацией 20 мМ/л в количестве 50 мкл. Через 10 мин. от начала реакции добавляли 1,5 мл 1 М раствора ацетата натрия (рН 4,3) при Т=4оС в каждую пробирку.
Добавляли в каждую пробирку по 200 мкл 2 % раствора аскорбиновой кислоты и молибдата аммония (NH4)6Mo7O24.4H2O - 2 г, концентрированной H2SO4 - 0,15 мл, CuSO4 - 5,5 мг, дистиллированной воды до 100 мл (для окрашивания реакционной смеси), что необходимо для визуализации образовавшегося неорганического фосфата из АТФ под влиянием Na-K-АТФазы.
Определяли количество неорганического фосфата в каждой пробирке путем колориметрирования при длине волны 750 нм. Судили о степени ингибирования Na-K-АТФазы стандартными растворами уабаина по разности экстинкций реакционной смеси в 1, 2, 3, 4, 5 пробирках по сравнению с 6-ой пробиркой (эталонной).
Строили кривую зависимости ингибирования Na-K-АТФазы от концентрации стандартных растворов уабаина, входящих в состав реакционных смесей и распределенных в 1, 2, 3, 4, 5 пробирках. Определяли разность экстинкций реакционных смесей в 7-ой пробирке, содержащей исследуемую плазму, по сравнению с экстинкцией 6-ой пробирки (эталоном) путем колориметрирования при длине волны 750 нм.
Определяли исходное содержание эндогенного дигоксиноподобного фактора в плазме крови по степени ингибирования Na-K-АТФазы в исследуемой пробе (пробирка № 7).
Определение активности Na-K-АТФазы мембран эритроцитов [128].
Кровь с гепарином центрифугировали при 1000 об/мин. 5 мин., плазму и лейкоциты удаляли. Осадок эритроцитов трижды промывали физиологическим раствором, центрифугируя каждый раз по 10 мин. при 3000 об/мин. К 3 мл осажденных эритроцитов приливали 30 мл охлажденного гемолизирующего буфера (10мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА; рН 7,4), быстро и тщательно перемешивали.
Мембраны осаждали при центрифугировании 20 мин. при 2500 об/мин. при температуре не более 4оС. Супернатант удаляли, красный осадок мембранного материала переносили в другие пробирки и отмывали гемолизирующим буфером 3-4 раза при тех же условиях центрифугирования. Определение активности Na-K-АТФазы проводили в инкубационной среде следующего состава (конечная концентрация, мМ): трис-HCl, pH 7,4 - 50, MoCl2 - 3, NaCl - 50, KCl - 5, ЭДТА - 6.
К 1,1 мл раствора, содержащего соответствующие компоненты, приливали 0,2 мл раствора АТФ (до конечной концентрации 2 мМ). Инкубировали реакционную смесь 1 час при 37оС. Для контроля неэнзиматического гидролиза АТФ использовали пробу, в которую вместо суспензии мембран добавляют 0,2 мл трис-HCl буфера. Через 1 час к инкубационной смеси добавляют 0,5 мл охлажденной до 0оС 10 % ТХУ и после перемешивания центрифугируют 5 мин.
В супернатанте определяли содержание неорганического фосфата. К 1 мл супернатанта приливали 2 мл 1 М ацетатного буфера, рН 4,6 0,5 мл молибдата аммония и 0,5 мл свежеприготовленного 1 % раствора аскорбиновой кислоты. Через 20 мин. спектрофотометрировали при длине волны 750 нм против контроля - 2,5 % ТХУ, которую обрабатывали так же, как и опытные пробы. Содержание фосфора определяли по калибровочной кривой. Активность фермента выражали в мМ неорганического фосфата (Фн),освободившегося за 1 мин. на 1 мг белка мембран. Содержание белка в суспензии мембран определяли по методу Лоури [90].
Концентрацию кальция и магния в плазме и эритроцитах крови определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии [97]. Принцип работы атомно-абсорбционного спектрофотометра основан на переводе анализируемой пробы в атомарное состояние с последующим фотометрическим преобразованием в электрический сигнал, который измеряется и регистрируется на самописце. Преимущество метода в высокой селективности, чувствительности, экспрессности.
Содержание натрия и калия в плазме и эритроцитах крови производили методом пламенной фотометрии [72]. Для определения этим методом концентраций натрия и калия растворы в распыленом виде под давлением вводятся в горящую газовую смесь высокой температуры. Интенсивность характерных линий спектра испускания данного электролита, возникающих при возбуж