РОЗДІЛ 2
ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 Матеріали і методи досліджень
Робота виконана в лабораторії біотехнології Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН впродовж 2002-2005 років.
Поширення хвороби Марека в світі вивчали за даними Міжнародного Епізоотичного Бюро (МЕБ), а в Україні - Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України і Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини.
Проведено обстеження п'ятнадцяти птахогосподарств різних форм власності чотирьох областей України та автономної республіки Крим. При оцінці епізоотичної ситуації враховували показники захворюваності та летальності [214]. Оцінювали ступінь ураження окремих органів і систем.
При наявності патологічних змін, властивих ХМ, відбирали уражені внутрішні органи та шматочки шкіри з пір'ям, а у клінічно хворих курей - цільну кров, котру стабілізували за допомогою гепарину 25-40 ОД/см3. Матеріал у стерильних флаконах з середовищем 199 з антибіотиками і ністатином доставляли до лабораторії у термосі з льодом або рідким азотом.
Для постановки експериментів нами були використані культури первиннотрипсинізованих фібробластів ембріонів курей, качок, індичок та перепілок, а також, культури епітеліоцитів нирок курчат та курячих ембріонів. Первинні культури фібробластів одержували шляхом трипсинізації 11-12-добових курячих, 8-9-добових перепелиних, 12-14-добових індичих та качачих ембріонів. Саму процедуру трипсинізації виконували за загальноприйнятими методиками [55]. Для виготовлення культури клітин з метою індикації ВХМ та визначення його інфекційної активності використано близько 200 курячих, 120 перепелиних, 30 качачих, 10 індичих ембріонів та 25 голів добових курчат (для відбору нирок).
Отримання первиннотрипсинізованої культури клітин нирки курчати проводили за методикою A. Miles [154].
У роботі також використана перещеплювана культура CEF (Chicken embryo fibroblasts) із колекції ІЕКВМ УААН.
Індикацію вірусу хвороби Марека в клінічному матеріалі, накопичення вірусної біомаси та вивчення титрів інфекційної активності здійснювали в культурах клітин ФЕК, НЕК та ФЕКач.
Життєздатність клітин визначали методом вітального фарбування 1 % водним розчином трипанового синього за допомогою камери Горяєва і світлової мікроскопії (ЛОМО, С.-Пб., Росія) при збільшенні х 50-100.
Як ростове живильне середовище для культур клітин використовували суміш середовищ ІГЛА та 199 у рівних об'ємах з додаванням 10 об.% нативної сироватки крові великої рогатої худоби (ДП "Ветеринарна Медицина").
Для створення банку первинних культур клітин, з метою полегшення поточної роботи з індикації та вивчення біологічних властивостей ізолятів ВХМ, частину суспензії первиннотрипсинізованих клітин заморожували і зберігали в біосховищі ХБ-05 з рідким азотом. Як кріозахисне середовище використовували суміш з середовищами ІГЛА і 199 (по 35%), 20% сироватки крові нативної ВРХ та 10% кріопротектору (диметилсульфоксид або димексид). Таким же способом проводили консервування вірусовміщуючих субстратів - тканинних суспензій, гомогенатів, інфікованих клітин, гомогенатів нативного патологічного матеріалу.
Для індикації вірусних агентів у клінічному матеріалі готували суспензії клінічного матеріалу 1:10 на основі стерильного розчину Хенкса з додаванням канаміцину сульфату (10000 ОД/см3) та 10 % розчину ністатину на ДМСО (0,01 г/см3). Матеріал розтирали у фарфоровій ступці зі стерильним піском або склом. Такі суспензії після освітлення центрифугуванням при 1000 об./хв впродовж 20 хвилин використовували для зараження клітинних культур, інокуляції в КЕ та екстракції сумарної ДНК для ПЛР-аналізу. При використанні з метою індикації ВХМ епітеліоцитів пір'яних фолікулів крім механічної дезінтеграції проводили дворазове заморожування та розморожування матеріалу, а потім гомогенізували в ступці. При ізоляції вірусу з лімфоцитів периферійної крові використовували метод зняття лейкоцитарної плівки з осаду еритроцитів центрифугованої стабілізованої крові хворої птиці та співкультивування інфікованих лімфоцитів в культурі фібробластів [11, 32].
При індикації вірусу в досліджуваному матеріалі здійснювали не менше чотирьох сліпих пасажів.
Після ураження 70-80 % клітин моношару їх знімали з поверхні скла культурального посуду за допомогою диспергуючої суміші, яка вміщувала 3 % розчин трипсину (Difco, США) у 0,02 % версені (ДП "Ветеринарна Медицина") у співвідношенні 1:20.
Інфекційну активність виділених ізолятів визначали зараженням культури ФЕК, що вирощували в культуральних флаконах об'ємом 50 см3, десятикратними розведеннями вірусовміщуючої суспензії. На кожне розведення брали по п'ять культуральних флаконів з вирощеним моношаром клітин. Облік ЦПД проводили на 3-4 та 6-7 добу після інфікування, після чого видаляли підтримуюче середовище, моношар фіксували 3 % розчином оцтової кислоти, фарбували 1 % водним розчином амідового чорного та підраховували кількість фокусів, утворених ВХМ. Інфекційну активність обчислювали за формулою:
КФ1 +КФ2 + КФ3 + КФ4 + КФ5
Т = х Р, (1)
N
де Т - титр вірусу; КФ1-КФ5 - кількість фокусів в кожному з матрасів; N - кількість матрасів на одне робоче розведення вірусного матеріалу; Р - розведення вірусного матеріалу при зараженні клітин.
Морфологічні особливості фокусів цитопатогенної дії вивчали за допомогою світлової мікроскопії з використанням окуляру-лінійки "Мир-4" (ЛОМО, С-Пб., Росія).
Оптимальні температурні режими для репродукції кожного з вивчених ізолятів підбирали шляхом культивування в культурі ФЕК при 37, 38, 39 і 400С в умовах термостату ЭТ-1.
Патогенність ізолятів ВХМ визначали зараженням на хоріон-алантоїсну оболонку 11-добових курячих ембріонів, а також 6-добових у жовтковий мішок [32, 125]. При розтині враховували морфометричні характеристики ембріонів, строки загибелі та наявність бляшок на ХАО. З цією метою використано близько 500 курячих ембріонів від племінного стада
- Київ+380960830922