РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень
2.1.1. Об`єкти досліджень
У роботі були використані ізольовані кільцеві сегменти правої і лівої легеневих
артерій та аорти щурів. Досліджувані судини видалялися у щурів забитих шляхом
цервікальної дислокації та розміщувалися у препарувальній чашці зі стандартним
буферним розчином Кребсу при кімнатній температурі. Судини були ретельно
очищені від сполучної тканини. Фрагменти аорти розрізали на кільцеві сегменти
під кутом приблизно 450, фрагменти легеневих артерій – 900, шириною біля 2–3 мм
та внутрішнім діаметром від 1 до 2 мм. Продовж 40–60 хвилин судинні сегменти
витримували у розчині Кребсу до початку експерименту.
Ізольовані судинні сегменти вирізали із 143 різностатевих дорослих щурів лінії
Wistar та щурів із генетично детермінованою артеріальною гіпертензією лінії
Okamoto, вагою від 200 до 250 г, які утримувалися на стандартному раціоні у
віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України.
2.1.3. Реактиви
Для приготування фізіологічного розчину Кребсу використовували хімічно чисті
компоненти (NaCl, NaHCO3, KCl, MgCl2 x 6H2O, CaCl2, NaH2PO4, C6H12O6) компанії
«Sigma» (США), які розчиняли у дистильованій воді в еквімолярних концентраціях.
При приготуванні розчинів, що були використані у методиці хімічного скінування
використовували хімічно чисті реактиви (b–есцин, NaАТФ, ДТЕ, CaCl2, Тріс HCl,
ЕГТА, імідазол, KCl, MgCl2) компанії «Sigma» (США).
У дослідах пригнічення протеїнкінази С здійснювали за допомогою челеритрину
хлорида та стауроспорину компанії «Sigma» (США).
2.1.2. Розчини
При виконанні препарувальних робіт був використаний безкальцієвий буферний
розчин Кребсу, склад якого представлено в таблиці 2.1 (А). Показник рН
буферного розчину Кребсу коливався в межах 7,3 – 7,4.
Таблиця 2.1
Хімічний склад фізіологічного безкальцієвого буферного розчину Кребсу для
проведення препарування ізольованих судинних препаратів (А) та розслаблюючого
та активуючого буферних розчинів для проведення досліджень скоротливої
активності хімічно скінованих ізольованих судинних препаратів (Б).
Речовина
Концентрація, мМ/л
NaCl
133,00
NaHCO3
16,30
KCl
4,70
MgCl2 х 6Н2О
1,05
NaH2PO4
1,38
С6Н12О6
7,82
Для проведення хімічного скінування ізольованих судинних препаратів, та
дослідження їх скоротливої активності використовували буферні розчини, які
різнились за своїм хімічним складом та позначені відповідно як розслаблюючий та
активуючий розчин. Їх хімічний склад наведено в таблиці 2.1 (Б). Показник рН
активуючого та розслаблюючого розчинів складав 6,8.
Речовина
Концентрація, мМ/л
Розслаблюючий
розчин
Активуючий
розчин
KCl
130,00
130,00
MgCl2
2,50
2,50
АТФ
3,30
3,30
ДТЕ
0,50
0,50
Тріс HCl
20,00
20,00
ЕГТА
4,00
Імідазол
20,00
20,00
СаСl2
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Методика реєстрації скоротливої активності ізольованих судинних
препаратів
Для проведення експериментальних досліджень використовувалася установка для
вивчення скоротливої активності ізольованих судинних сегментів. Блок–схему
установки подано на рисунку 2.1.
В робочій камері установки судинні кільця закріплювалися з одного боку на
стаціонарному гачку, а з іншого – на гачку приєднаному до штоку тензодатчику.
Постійна перфузія розчинів у камері підтримувалася багатоканальним
перистальтичним насосом IPS ISM 930 «Ismatec»
(Німеччина). У дослідах температура розчинів у камері складала 37 0С, що було
досягнуто за допомогою системи нагрівання розчинів в камері. Контроль
температури здійснювали за допомогою термодатчиків, розташованих на виході
перфузійної системи із камери, вході до камери та власне в камері. Перфузійні
розчини аерували газовою сумішшю O2 – 21 %, CO2 – 5 %, N2 – 74 %.
Після розміщення в перфузійній камері судинні препарати піддавали натягу з
силою приблизно 400 мг для препаратів легеневої артерії та 2000 мг для
препаратів аорти. Ці умови були створені для надання ізольованим судинним
препаратам початкового тонусу.
Реєстрація скоротливої активності хімічно скінованих ізольованих судинних
препаратів здійснювалась в режимі наближеному до ізометричного за допомогою
датчиків напруження, в якості яких використано перетворювачі type DY1 «Ugo
Basile» (Італія). Запис скоротливої активності ізольованих судинних препаратів
здійснювали на папері за допомогою багатоканальних самописців моделей Н3031 або
model 202 «Cole Parmer Instrument Company» (США).
2.2.2. Методика хімічного скінування кільцевих сегментів кровоносних судин
Для оцінки Са2+–чутливості скоротливого апарату гладеньком`язових клітин нами
було використано методику хімічного перфорування або пермеабілізації
(скінування) клітинної мембрани [148, 98, 110, 90, 144], яка дозволяє задавати
фіксовану внутрішньоклітинну концентрацію іонів Са2+ та реєструвати амплітуду
відповідного скорочення ізольованих судинних сегментів. Скінування ізольованих
судинних препаратів здійснювали за допомогою холістерол–преципітуючого
детергенту b–есцину, ефіру сапоніну.
Після розташування та розтягнення судинних сегментів у камері тензометричної
установки, їх на 30 хвилин залишали у розслаблюючому розчині (його склад
приведено у табл. 2.1). Для отримання пор у плазматичній мембрані міоцитів у
розслаблюючий розчин додавали b–есцин у концентрації 0,05 – 0,1 мг/мл. Час
експозиції b–есцину становив 10 та 18 хв. для легеневої артерії та аорти
відповідно. Залишковий Са2+, що вивільнявся з кальцієвих депо
саркоплазматичного ретикулуму зв`язувався кальцієвим хелатором етилен
гліколь-біс(2-аміноетілер)-N,N,N`,N`-тетраацетиловою кислотою (ЕГТА).
Скорочення
- Київ+380960830922