РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
Предметом вивчення цієї роботи є порівняння методів дослідження фармакологічних
і токсикологічних властивостей лікарських засобів на клітинній лінії та in
vivo.
Для цього в експерименті використовувалася клітинна лінія трансформованих
гепатоцитів HepG2. Лінія була створена за допомогою вірусного вектора і
використовується для вивчення токсикологічних і фармакологічних властивостей
різних ксенобіотиків [15, 33, 109]. Це частково диференційована лінія клітин з
експресією цитохрома Р450 [207, 213]. Вказана культура - одна з клітинних
ліній, що є релевантною системою для вивчення гострої і хронічної токсичності,
викликаної хімічними агентами і лікарськими засобами [85, 116, 178, 202].
Оскільки в якості об’єкту дослідження були обрані гепатоцити, відповідно ми
обрали для дослідження гепатопротектори: силібор, глутаргін, ліолів. Силібор
(серія 191199) і глутаргін (дослідно-промислова серія) – препарати, що
випускаються ТОВ «Фармацевтична компанія «Здоров'я», ліолів
(дослідно-промислова серія) - ЗАТ «Харківське підприємство з виробництва
імунобіологічних і лікарських засобів «Біолек».
Також нами був обраний для проведення експерименту кардіопротектор Предуктал
таблетки, вкриті оболонкою, по 20 мг (серія 2Н5016) – компанія “Серв’є”,
Франція. Ціллю введення до експерименту цього препарату було довести
придатність використовуваної культури клітин HepG2 для вивчення
гепатопротекторних та гепатотоксичних властивостей хімічних сполук при
проведенні скринуючих досліджень на етапі доклінічних досліджень.
Діючою речовиною Предукталу є триметазидин -
1-[(2,3,4-триметоксифеніл)метил]піперазин (у вигляді дигідрохлориду) [168].
Дані літератури свідчать про те, що триметазидин виявляє позитивний вплив на
усі процеси, що мають місце у ішемізованому міокарді [35, 52, 139, 143, 203,
215].
Культура клітин HepG2 (колекція ATCC HB 8065; ECACC 85011430, SPBIC) –
виробництва Лабораторії молекулярної біології МГНЦ РАМН.
Для відтворення токсичного ураження на культурі гепатоцитів як токсин
використовували СС14, тетрациклін, Д-галактозамін і гентаміцин. Перші три
речовини відносяться до, так званих, істиних гепатотоксинів і традиційно
використовуються в експериментальній практиці для створення модельної патології
печінки у тварин. Гентаміцин з цією метою на тваринах не застосовувався. Він
володіє вираженими нефро- та ототоксичними властивостями [130, 151, 214]. За
даними літератури відомо, що цей антибіотик виявляє також гепатотоксичну дію
[4, 50, 126, 131, 157, 160, 162, 170, 171, 182].
Для СС14, тетрацикліну і Д-галактозаміну характерна безпосередня цитотоксична
дія на гепатоцит, відносно короткий час між впливом гепатотоксину і ураженням
клітин печінки, залежність ступеня ураження від величини дози гепатотоксичного
агента, можливість адекватного відтворення ураження печінки у експериментальних
тварин [60].
СС14 широко й успішно застосовується в експериментальній фармакології як агент
для моделювання токсичних уражень печінки. Його нетривале введення (2-4 дня)
експериментальній тварині у високих дозах викликає розвиток ознак гострої
жирової дистрофії печінки, аналогічних за біохімічними і морфологічними
проявами гострому токсичному гепатитові у людини [19, 53, 63].
Молекулярні механізми цитотоксичної дії CCl4 зв'язані, насамперед, з його
біотрансфомацією у мембранах ендоплазматичного ретикулуму за участю цитохрому
Р450 [5, 18, 20, 41]. В результаті утворюються високореакційні вільні радикали
і , що виконують роль ініциіаторів перекисного окислювання ненасичених жирних
кислот у мембранах гепатоцитів, що показано як на модельних системах
(ізольовані гепатоцити, мікросомальна фракція печінки), так і в умовах in vivo
[14]. Ушкодження мембран гепатоцитів призводить до порушення функціонування
ферментних і неферментних систем ПОЛ, падінню активності більшості
внутрішньоклітинних ферментів, ослабленню антитоксичної функції печінки,
порушенню білок- і глікогенсинтезуючої системи гепатоцитів [14]; вивільненню
клітинних ферментів у плазму крові з формуванням синдрому цитолізу [9, 11]. У
печінці тварин, отруєних CCl4, розвиваються важкі ураження у виді масивних
центролобулярных некрозів, жирової дистрофії і пігментного цирозу [60].
Тетрациклін, виявляючи пряму ушкоджуючу дію на печінку, інгибує
сукцинатдегідрогеназну, цитохромоксидазну, аргіназну активність гепатоцитів
[21, 62]. У гепатотоксичній дії тетрацикліну одне з перших місць займає
пригнічення синтезу білка на етапі трансляції й елонгації [8], що є прямим
наслідком його прооксидантної дії. Відомо, що тетрациклінові антибіотики
стимулюють генерацію високореакційних радикалів кисню, що провокує надмірну
перекісну деградацію ДНК, яка відповідає за синтез білка в печінці [185].
Зменшення транспортних форм аполіпопротеїнів закономірно призводить до
формування жирової дистрофії [37]. Тетрациклін знижує інтенсивність аеробного
подиху і сполученого з ним окисного фосфорилювання, порушує обмін вуглеводів,
білірубіну [12]. Накопичування високотоксичних продуктів ПОЛ призводить до
порушення цілісності мембран гепатоцитів і їх органелл, зниження рівня
біоенергетики різних обмінних процесів у печінці. Препарат вироблений ФК
«Дарниця», серійний номер 120201.
Гентаміцин також виявляє пряму ушкоджуючу дію на клітини. При надходженні до
клітин він порушує нормальну реабсорбцію білків у канальцях. Зокрема,
зв'язується з глікопротеїном 330, який є медіатором клітинного захоплення і
токсичності гентаміцину [127]. Гентаміци
- Київ+380960830922