РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Отримання, культивування та морфологічне дослідження клітин НЦ
Культури клітин отримували з НЦ людини, вилучених під час проведення нейрохірургічних операцій з приводу базальних позамозкових пухлин (менінгіом), а також з НЦ зрілих щурів-самців білої безпородної лінії у віці 5,5 міс. У стерильних умовах у поживному середовищі Ігла (Eagle's medіum, Sigma) кожну НЦ ad oculus максимально очищали від судинної оболонки, після чого тканину НЦ подрібнювали мікроножицями і дисоціювали багаторазовим механічним піпетуванням в середовищі Ігла, згідно з протоколами, розробленими для культивування нервової тканини [209]6.
Вивчення динаміки клітинного складу, тривалості переживання та диференціювання клітин НЦ проводили у присутності безсироваткового середовища, середовища із вмістом фетальної телячої сироватки у концентрації 1% та у середовищі із вмістом ретиноєвої кислоти (Retinoic acid, Sigma) у концентрації 2?10-6 М/л. З метою оцінки проліферативного потенціалу нейрогенних клітин НЦ отриману суспензію культивували в живильному середовищі DMEM (Dulbecco's modіfіed Eagle's medіum, Sigma) стандартного складу, що включало фетальну телячу сироватку (40%), глюкозу (800 мг/%), інсулін (0,2 од/мл), з наявністю рекомбінантного епідермального фактору росту людини (hEGF, експресований E. colі; Sіgma) у концентрації 40 нг/мл і рекомбінантного фактору росту фібробластів людини (hFGF, експресований E. colі; Sіgma) у концентрації 20 нг/мл.
Для підсаджування клітин на адгезивний субстрат первинну клітинну суспензію центрифугували при швидкості 1,5 тис об/хв продягом 60 сек, надосад-ковий шар клітинної суміші обережно відбирали мікропіпеткою і наносили по 1-2 краплини на адгезивні покривні скельця у пластикових чашках Петрі з поперед-ньо нанесеним поліетиленіміном і на 2-гу добу додавали необхідне середовище.
Культивування здійснювали в СО2-інкубаторі (ОКПІО АНУ, Україна) при по-стійній температурі (36?С), вологості (90%) і вмісту СО2 (5%). Заміну живильного середовища проводили кожні 3-4 доби. Додавання факторів росту проводили щодві доби. В процесі культивування періодично визначали кількість живих і мертвих клітин у 1 мл суспензії за допомогою стандартного тесту з трипановим синім у камері Горяєва.
З метою отримання клітинних суспензій для трансплантації вміст флакону цен-трифугували при швидкості 2 тис об/хв протягом 20 хв, і відбирали 1 мл центри-фугату. У такому вигляді суспензії під час проведення оперативних втручань (1,5-2 год) утримували в термостаті при температурі 37?С. Для трансплантації відбирали необхідний об'єм суспензії, попередньо збовтуючи вміст пробірки.
Живі культури, висаджені на адгезивний субстрат, а також первинні експланта-ційні культури спостерігали щоденно в інвертованому мікроскопі БИОЛАМ П-3 (ЛОМО, Санкт-Петербург). Фенотипічні особливості нейроклітин вивчали на ци-тологічних препаратах культур, фіксованих у 10% розчині нейтрального формалі-ну і фарбованих гематоксиліном Карачі та тіоніном за Ніслем. Гістологічні препа-рати культур у динаміці спостереження вивчали за допомогою світлооптичного мікроскопа Axiophot (OPTON, Німеччина) та цитоаналізатора зображення IВAS-2000 (KONTRON, Німеччина) з наступною цифровою та аналоговою фото-реєстрацією.
2.2. Моделювання травми спинного мозку і трансплантація клітин НЦ
2.2.1. Експериментальні тварини та експериментальні групи.
Вивчення ефективності імплантації макропористого гідрогелю та алотранс-плантації клітин НЦ на моделі травми спинного мозку проводили на білих безпо-родних щурах-самцях, вагою 250-300 гр. Середній вік тварин складав 5,5 міс.
У ході експериментального дослідження були сформовані такі експеримен-тальні групи тварин: група "контроль" (у тексті також фігурує назва контрольна група) - моделювання ЛПП спинного мозку (n=24); група "гідрогель", тваринам якої безпосередньо після нанесення травми в ділянку ушкодження спинного мозку імплантували гідрогель (n=37); група, тваринам якої через 4 тиж після нанесення травми й імплантації гідрогелю в тканину спинного мозку та навко-лишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=12); група, тваринам якої через 8 тиж після нанесення травми й імплантації гідрогелю в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=8); група, тваринам якої через 7 тиж після нанесення травми в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=4); група, тваринам якої через 13 тиж після нанесення травми в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=4). Група тварин, котрим через 4 тиж після моделювання травми та імплантації гідрогелю трансплантували клітини НЦ була розділена на дві підгрупи: тварини із кращими (n=5) та гіршими (n=7) показниками відновлення функції задньої іпсилатеральної місцю травми кінцівки (ЗІК) на момент виконання ТКНЦ. Для порівняльної оцінки даних електрофізіологічного дослідження провідності спинного мозку було сформовано групу інтактних тварин (n=11).
2.2.2. Отримання, транспортування і зберігання макропористого гідрогелю.
Макропористий гідрогель (полі[N-(2-гідроксипропіл)-метакриламід], надалі - гідрогель) був синтезований в лабораторії E. Pinet (FISO Technologies Inc., Quebec, Canada) шляхом гетерогенної полімеризації із наступним очищенням у спиртових і водяних ваннах, після чого гідрогель стерелізували у дистильованій воді шляхом автоклавування і запаювали в скляні ємності. Росфасований в стерильних умовах після транспортування гідрогель утримували протягом усього експерименту при температурі 6-8? С. Вміст однієї пробірки використовували для імплантації 4-6 тваринам протягом одного операційного дня.
2.2.3. Моделювання травми спинного мозку.
Для моделювання спінальної травми нами була використана модель ОПП спинного мозку в нижньогрудному відділі, а саме її лівобічний варіант - ЛПП. Усі маніпуляції п