РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМКІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Дослідження проводили в період з 2003 по 2008 рр. у лабораторії анаеробних
інфекцій ІВМ УААН, тваринницькому господарстві ДГ „Асканія Нова” Херсонської
області, бактеріологічному відділі ДНДІЛДВСЕ, лабораторії кафедри лабораторної
діагностики інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин БДАУ.
Методологічною основою визначення напрямку досліджень були літературні дані про
поширення серед тварин збудників лістеріозу, які мають особливості антигенної
структури і біології, спричиняють розвиток інфекційного захворювання. Важливою
підставою для виконання роботи стала необхідність удосконалення діагностичних
підходів та створення вітчизняної інактивованої вакцини проти лістеріозу.
2.1. Методи досліджень
Бактеріологічні дослідження проводили згідно зі схемою, представленою на рис.
2.1.
Рис. 2.1. Схема лабораторного дослідження на лістеріоз.
Технологічна схема виробничого процесу при виготовленні концентрованої
інактивованої вакцини „Лістерисан” проти лістеріозу тварин представлена на рис.
2.2.
Рис. 2.2. Схема виробництва інактивованої концентрованої вакцини проти
лістеріозу тварин „Лістерисан”.
З метою вивчення імунної відповіді організму овець, щеплених вакциною
„Лістерисан”, проведено дослідження, які наведені на рис. 2.3.
Рис. 2.3. Схема вивчення імунної відповіді організму тварин, щеплених вакциною
проти лістеріозу „Лістерисан”.
2.2. Матеріали для досліджень
В експериментальній роботі були використані лабораторні та сільськогосподарські
тварини:
* безпородні білі миші масою 14–16 г – 660 голів;
* мурчаки масою 300 г – 40 голів;
* кролі масою 1,5–2,0 кг – 20 голів;
* барани-донори еритроцитів – 2 голови;
* вівці віком 2–3 роки – 6057.
2.3. Методи індикації та ідентифікації лістерій
2.3.1. Штами культур
У роботі використовували 40 культур лістерій, з них Listeria monocytogenes
становило – 15 польових ізолятів, L. ivanovii – 2, L. innocua – 10, L.
seeligeri – 2, L. welshimeri – 2, L. grayi – 8 відповідно. Культури виділені з
патологічного матеріалу від хворих тварин та трупів (хутрових звірів, дрібної
рогатої худоби, свиней, великої рогатої худоби), а також із харчових продуктів
та сировини тваринного походження (мўясо птиці, шкіра та гузок гусячий) з
тваринницьких господарств Херсонської, Кіровоградської, Чернівецької,
Луганської, Вінницької, Черкаської та Івано-Франківської областей України, а
також референс-штам Listeria monocytogenes № 1, одержаний з колекції музею
ДНКІБШМ.
Виробничі штами лістерій. Для виготовлення концентрованої інактивованої вакцини
проти лістеріозу тварин “Лістерисан”, “Набору еталонних тест-культур для
ідентифікації лістерій” (ТУ У 24.4 – 00699715-001:2007), а також для контролю
активності вакцини “Лістерисан” використовували штами лістерій: Listeria
monocytogenes № М-04 (виробничий, типовий, містить О-антигени типів І, ІІ);
Listeria monocytogenes № АТСС 19112; Listeria ivanovii № 402; Listeria innocua
№ АТСС 33090.
Крім того, для роботи використано штами E.coli, Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, одержані з колекції музею
ДНКІБШМ та Micrococcus lysodekticus (“Биохимреактив”, Олайне).
2.3.2. Методи бактеріологічних досліджень
Для визначення оптимальних умов індикації збудника посіви патологічного
матеріалу проводили різними способами:
* методом відбитків – вирізали шматочок тканини масою 1 г та внутрішньою
поверхнею прикладали до поверхні середовища (на кожну пробу використовували по
2 чашки Петрі), для контролю цей же матеріал паралельно вносили в МПБ;
* пастерівською піпеткою (її гострим кінцем) проколювали поверхню проби,
насмоктували матеріал, який вносили в середовище;
* посів гомогенату, розтертого на стерильному фізіологічному розчині з піском
(2 г проби + 2 г піску + 10 см3 фізрозчину) та без нього;
* посів відбитком та гомогенатів проб, які витримували в термостаті за
температури +37°С протягом 6 годин;
* посів відбитком та гомогенатів проб після 10-денного їх витримування в
холодильнику за температури +4°С.
Для культивування штамів лістерій, вивчення їх морфологічних, культуральних та
біохімічних властивостей, виготовлення антигенів використовували такі живильні
середовища: пептонно-буферну воду, рН 7,2–7,4; м’ясо-пептонний бульйон (МПБ),
рН 7,2–7,4; триптон-соєвий бульйон з дріжджовим екстрактом (ТСБДЕ); бульйон
Фрейзера концентрований та напівконцентрований; 2,5 %-й м’ясо-пептонний агар
(МПА), рН 7,2–7,4; триптон-соєвий агар з дріжджовим екстрактом (ТСАДЕ); МПА та
МПБ з 1 % глюкози та з 2 % гліцерину; ПАЛКАМ агар; Оксфордський агар;
середовища Гісса; МПА з вмістом 1 % калію телуриту; індикаторні середовища (з
лакмусом, нейтралротом в суміші з метиленовою синькою, метилротом, конгоротом,
амідочорним); кров’яний МПА та колумбійський агар з вмістом 5–7 % еритроцитів
барана (виробництва Pronadisa, Himedia, Scharlau). Виготовлення живильних
середовищ проводили відповідно до інструкцій виробника та згідно із
загальноприйнятими методиками [111].
Для тривалого зберігання культур їх ліофільно висушували. Попередньо культури
вирощували на триптон-соєвому агарі з дріжджовим екстрактом за температури +25
– +28?С. Після отримання 2-добової культури штамів їх змивали триптон-соєвим
бульйоном з дріжджовим екстрактом до концентрації 2109 м. к./см3 та у
співвідношенні 1:1 з'єднували з цукрозо-желатиновим середовищем. Суміш
розфасовували по 1см3 у стерильні ампули об'ємом 5–6 см3, закривали стерильними
ватними тампонами та заморожували при –62?С протягом