РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об'єктами досліджень були культури мікобактерій туберкульозу
* людського, штам 1848 та
* бичачого, штам 8 видів,
які шляхом восьмиразового тривалого (протягом 720 діб) послідовного пасажування були адаптовані до організму курей.
Досліди по адаптації здійснені в лабораторії мікробіології тварин Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН протягом 1991-1995рр.
У роботі також використовували референтні штами мікобактерій туберкульозу таких видів:
* людського, штам 1848,
* бичачого, штам 8 та
* пташиного, штам 14141.
Усі вищезазначені культури були взяті із музею штамів мікобактерій лабораторії мікробіології тварин ІСГМ УААН (м. Чернігів).
Вивчення трансоваріальної передачі мікобактерій туберкульозу ссавців, адаптованих до організму курей, проводили за наступною схемою:
* вивчення вихідних культурально-морфологічних, біохімічних та патогенних ознак адаптованих до організму курей мікобактерій туберкульозу людського і бичачого видів у порівнянні із референтними штамами;
* вивчення розвитку інфекційного процесу у курей, експериментально заражених адаптованими до їх організму M. tuberculosis та M.bovis (виявлення сенсибілізації інфікованих птахів щодо туберкулінів та накопичення у їх крові специфічних антитіл, патологанатомічне та бактеріологічне дослідження внутрішніх органів після закінчення строку спостереження);
* дослідження інфікованості яєць курей, штучно заражених адаптованими до них мікобактеріями туберкульозу людського і бичачого видів у порівняльному аспекті;
* проведення досліду по штучному інфікуванню яєць, одержаних від здорових курей, адаптованими до птиці культурами мікобактерій людського та бичачого видів, виділених трансоваріально, з наступною їх інкубацією та спостереженням за розвитком ембріонів, а також патологоанатомічне та бактеріологічне дослідження завмерлих ембріонів, ембріональних оболонок та внутрішніх органів від загиблих курчат.
* вивчення культурально-морфологічних, біохімічних та патогенних властивостей адаптованих до організму курей мікобактерій туберкульозу ссавців, ізольованих з яєць;
* вивчення стабільності набутих в результаті багаторазових довготривалих пасажів через організм курей властивостей мікобактерій туберкульозу людського та бичачого видів у дослідах на морських свинках.
Для виконання вищезазначених робіт застосовували бактеріологічні (бактеріоскопічні, культуральні, біологічні), алергічні, серологічні, патоморфологічні та статистичні методи.
Всього при проведенні експериментальних досліджень використано 66 курей, 36 кролів, 66 морських свинок, бактеріологічно досліджено 420 проб яєць, 798 проб патматеріалу.
Бактеріоскопічний метод застосовували з метою швидкого виявлення у досліджуваному матеріалі мікобактерій туберкульозу. Матеріалом для досліджень слугували проби внутрішніх органів піддослідних тварин, яєць, посліду від курей, тканин ембріонів, ембріональних оболонок, внутрішніх органів курчат.
Досліджуваний матеріал ретельно розтирали між предметними скельцями, фіксували над полум'ям та проводили мікроскопію препаратів-мазків, пофарбованих за Ціль-Нільсеном в імерсійній системі під мікроскопом МБІ-15.
Для виділення із досліджуваного матеріалу чистих культур мікобактерій туберкульозу та визначення їх основних властивостей використовували культуральний метод.
Передпосівну обробку проб внутрішніх органів піддослідних тварин, тканин ембріонів, ембріональних оболонок, внутрішніх органів курчат здійснювали за методом А.П. Алікаєвої (1940).
Яйця перед висівом на поживне середовище спеціальній обробці не піддавали. Проте, шкаралупу яєць ретельно обтирали ватним тампоном, змоченим у спирту, та обпалювали над полум'ям.
Для культивування мікобактерій використовували елективне, щільне, яєчне середовище Левенштейна-Йенсена. Висіви з кожної проби внутрішніх органів піддослідних тварин, тканин ембріонів, ембріональних оболонок, внутрішніх органів курчат проводили на шість пробірок, а з кожної проби яєць (окремо з білку і з жовтку) ? на вісім пробірок.
Пробірки з висівами інкубували у термостаті протягом трьох місяців при температурі 37?С з регулярним переглядом через кожні 7 діб. При виявленні колоній мікроорганізмів вивчали їх тинкторіальні властивості: пофарбовані за Ціль-Нільсеном мазки з цих колоній переглядали під мікроскопом МБІ-15.
Вивчення властивостей виділених мікобактерій проводили лише у чистих культур у першій генерації після пересіву на поживне середовище за допомогою ряду культурально-морфологічних та біохімічних тестів.
Із культурально-морфологічних властивостей у культур мікобактерій вивчали:
* швидкість росту: пробірки із щільним середовищем засівали зависсю культури мікобактерій (по 2 краплі на кожну пробірку) у концентрації 1мг бактеріальної маси в 1 мл стерильного фізіологічного розчину хлориду натрію. При цьому ріст оцінювали з моменту утворення сформованих колоній;
* ріст колоній мікобактерій при різних температурах: пробірки із щільним середовищем засівали зависсю культури мікобактерій, після чого по три пробірки інкубували при температурах 25?, 37?, 41?С. Появу росту колоній виявляли на протязі двох місяців з інтервалами 3-5 діб, а його інтенсивність оцінювали за 4-бальною системою:
"+"?поодинокі колонії(1?10);
"++"? значна кількість колоній (11-50);
"+++"? безліч колоній (51-100);
"++++"? суцільний ріст злитих колоній;
* характер росту і морфологію колоній на щільному середовищі (форму, розмір, колір, рельєф, поверхню, консистенцію);
* морфологію мікобактерій (довжину і ширину бактерій, форму, наявність зерен);
* стійкість до знебарвлення активним хлором (Л.Е.Скрябіна, 1955). Обробка препаратів-мазків спиртом протягом 40?60 хвилин та 1 % розчином гіпохлориту калію до 1 години 30 хвилин дає можливість диференціювати мікобактерії туберкульозу із зміненими властивостями від кислотостійких сапрофітів.
Для ідентифікації мікобактерій
- Київ+380960830922