РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ.
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Експериментальна частина роботи виконана на кафедрах фізіології тварин імені С.В.Стояновського та ветеринарно-санітарної і радіологічної експертизи Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З.Гжицького протягом 2000-2003 років.
У процесі виконання роботи нами було проведено серію дослідів (табл. 2.1.).
Таблиця 2.1.
Схема та мета досліджень
№ дослідуМета дослідуДослід 1Визначення вмісту мікроелементів у кормах Жовківського району Львівської областіДослід 2Розробка лабораторного регламенту синтезу координаційних сполук дефіцитних мікроелементів з цистеїном.Дослід 3Апробація преміксу в умовах in vitroДослід 4Вивчення ефекту дії після застосування різних форм дефіцитних мікроелементів на організм бугайців в ТзОВ "Галичина" Жовківського району Львівської області. Експериментальне обґрунтування методики застосування цистеїнатів дефіцитних мікроелементів. У досліді № 1 попередньо було проведено аналіз кормової бази Жовківського району Львівської області з метою вивчення мінерального забезпечення тварин макро- та мікроелементами.
Досліджено мінеральний склад кормів у п'яти господарствах, розміщених у різних біогеохімічних зонах, зокрема: ТзОВ "Галичина "с. Погарисько, "Підлісне" с. Зіболки, "Вільна Україна" с. Дев'ятир, "Пролісок" с.В'язова, "Щекотин" с. Глинсько Жовківського району Львівської області. Дослідження проводились на атомно-абсорбційному спектрофотометрі типу ААS-30 в полум'яному режимі з використанням стандартних методів [Додатки 1-4].
Відповідно до мети, визначено мінеральний склад кормів раціону тварин дослідних господарств: коренебульбоплодів, соковитих, концентрованих та грубих кормів.
Отримані дані вказують, що в переважній більшості кормів є низький вміст заліза, міді, кобальту та марганцю, а звідси і недостатній рівень забезпеченості ними організму тварин. Виявлений дефіцит цих мікроелементів в кормових культурах вимагає додаткового внесення до раціону тварин відповідних мікроелементів або спеціальних мікроелементних преміксів.
На основі цих даних провели корекцію раціонів тварин за мінеральним складом з метою профілактики мікроелементозів, підвищення продуктивності тварин, покращення якості тваринницької продукції та рентабельності виробництва
У досліді № 2 розроблено лабораторний регламент синтезу координаційних сполук мікроелементів з амінокислотою цистеїн, який може бути основою для виробництва преміксів [104].
Для синтезу хелатних сполук використовували солі CuSO4; FeSO4; MnSO4; CoSO4, амінокислоту цистеїн. Дослідження вмісту металів проводилось на атомно-абсорбційному спектрофотометрі типу ААS-30 в полум'яному режимі з використанням стандартних методів, pН - за допомогою універсального іономіра ЕВ-74, інфрачервоні спектри - за допомогою спектрофотометра Specord M-400 (Німеччина).
Синтез хелатних сполук мікроелементів з амінокислотою цистеїном проводили за стадіями.
1. Отримання розчину цистеїнату натрію. Цистеїн розчиняють у 3N розчині NаOH при 40 0 С та доводять водою до концентрації цистеїнату в розчині 10-15%.
2. Отримання хелатних сполук на основі цистеїну та іонів двовалентних металів Cu2+, Mn2+, Fe2+, Co2+.
До розчину метіонату натрію (2,0 екв.) поступово протягом 0,5 год. при інтенсивному перемішуванні додавали 30%-й розчин сульфату відповідного металу (1,0 екв.) Суміш охолоджували до 2-40С, осад цистеїнату мікроелемента, що випав, фільтрували та висушували у вакуумній шафі при 700С протягом 75 годин (3-4 стадія)
У результаті досліду були встановлені оптимальні умови синтезу: температура розчину 18-190С, час синтезу - 75 годин. Хімічний склад та будова синтезованих хелатів мікроелементів підтверджені фізико-хімічними методами аналізу. Елементарним аналізом визначено відсотковий вміст C,S,H,N. Процес синтезу контролювали регулярним визначенням та вивченням смуг абсорбції у видимій та ультрафіолетових ділянках спектрів за допомогою спектрофотометра Specord M-400 .
Вивчення спектральних характеристик одержаних сполук показало, що при збільшенні часу синтезу металохелатних комплексів збільшується коефіцієнт їх молярного поглинання зв'язаного NH-зв'язку у видимій ділянці спектра 400-750 нм, що пов'язано із збільшенням кількості іонів, які перейшли в координаційний стан. Це підтверджує хелатну будову цих сполук. Віднесення смуг поглинання інших угрупувань добре корелює з довідниковими даними.
У досліді № 3 проведено апробацію преміксу в умовах in vitro (табл. 2.2).
Для дослідження впливу неорганічних солей мікроелементів, амінокислоти цистеїну та їх хелатних комплексів на інтенсивність споживання кисню in vitro (полярографічно, нг-атом О/0,1 мл суспензії клітин за хвилину) використано модельну тест-систему - культуру клітин гранульозного шару фолікулів яєчника корів (гранульоза).
Спосіб забезпечує високу чутливість і здатність до відтворення, низьку вартість, швидке отримання результатів, надійність контролю за якістю проведення досліджень.
Після забою у корів відбирали яєчники та шляхом аспірації фолікулів отримували суспензію клітин. Центрифугували (2000 об./хв), декантували, суспендували у фосфатно-сольовому буфері. Інкубували відмиті клітини 10-12 годин у середовищі RPMI - 1640 ( Flow laboratories).
Культура клітин гранульози не вимагає спеціальних обробок (трипсинізація), особливих умов підготовки та культивування, а клітини характеризуються гліколізом та диханням.
Отже, культура клітин гранульозного шару фолікулів характеризується максимально подібними параметрами метаболізму, які властиві для цілого організму тварин.
Таблиця 2.2.
Схема досліду
№ дослідуСклад преміксуКонтрольСередовище (С)1 дослідСередовище + FeSO4 - 0,05, СuSO4 - 0,05, MnSO4 - 0,05, СoSO4 - 0,03 мкг/мл2 дослідСередовище + цистеїн - 0,02 мкг/мл3 дослідСередовище + FeSO4 - 0,05, СuSO4 - 0,05, MnSO4 - 0,05, СoSO4 -0,03, цистеїн - 0,02 мкг/мл
- Київ+380960830922