Розділ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна характеристика обстежених хворих
Предмет дослідження - клітини перитоніального ексудату і периферичної крові, які були одержані від 94 хворих з гострою хірургічною патологією, прооперованих з приводу гострого апендициту (24 хворих), перфорації виразки шлунку та дванадцятипалої кишки (30 хворих), гострого холециститу та іншої гострої хірургічної патології (40 хворих). При вивченні системної імунологічної відповіді в якості контролю досліджувались клітини, а також сироватка периферичної крові практично здорових осіб (22 донори). Загальна кількість обстежених 116 осіб. Хворі були прооперовані в Київській міській клінічній лікарні швидкої медичної допомоги, що є клінічною базою кафедри хірургії стоматологічного факультету Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця. Всі обстежені хворі в залежності від характеру перебігу післяопераційного періоду були розподілені на дві групи. Перша (56 хворих) - зі сприятливим післяопераційним перебігом, у яких розвивався місцевий серозний або серозно-фібринозний перитоніт. Друга (38 хворих) - з гнійно-фібринозним перитонітом. Детальна характеристика хворих представлена в розділі 3 (Табл. 3.1).
2.2. Методи дослідждення
2.2.1. Одержання клітин перитоніального ексудату. Клітини перитоніального ексудату (КПЕ) отримували в динаміці (під час операції та через 24 - 72 години після операції). Шприцем (20 мл) в день операції з черевної порожнини і через 24 - 72 після операції з дренажа одержували ексудат. У випадках відсутності відтоку ексудату з дренажа в дренажну трубку вводили стерильний фізіологічний розчин в об'ємі 20,0-50,0 мл і через 5 хв одержували суміш з КПЕ. Одержані клітини відмивали забуференим фізіологічним розчином (ЗФР), що додавали до ексудату у відношенні 1:1 та центрифугували в звичайних центрифужних пробірках в центрифузі з горизонтальним ротором при 1000 об/хв двічі по 15 хв. Після чого підраховували кількість життєздатних КПЕ в камері Горяєва з 0,1% розчином трипанового синього по загальноприйнятій методиці. Для подальшої роботи використовували концентрацію клітин не менше 2,0-4,0х106 клітин в 1 мл ЗФР. Одержану суспензію КПЕ використовували для виготовлення цитологічних препаратів, фіксували метанолом, фарбували за Романовським-Гімза і підраховували відсоток перитоніальних макрофагів, нейтрофілів, лімфоцитів та інших клітин.
2.2.2. Метод непрямої імунофлуоресценції. За допомогою цього методу визначали популяційцний та субпопуляційний склад лімфоцитів перитоніального ексудату і периферичної крові, а також експресію активаційних маркерів з використанням моноклональних антитіл. Досліджувались лімфоцити з маркерами CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, рецептор ІЛ-2 (CD25), адгезивні молекули (CD54), антигени ІІ класу ГКГ (HLA-DR) та рівень внутрішньоядерного маркера проліферації. Використовувались моноклональні антитіла, виготовлені в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького (м. Київ) та в Інституті експериментальної імунотерапії Російського онкологічного центру (м. Москва).
Непрямий варіант імунофлуоресцентного методу з використанням МКАТ проводили на предметних скельцях, які попередньо були знежирені у суміші Нікіфорова. На скельця поміщали смужки Раrafilm М (American Can Company, USA) з 8-12 отворами діаметром 5 мм Після прикріплення Раrafilm М до лунок вносили по 10 мкл розчину poly-L-lisine (100 мкг/мл у ЗФР, м.м.40-80 кД, Sigma, USA) та інкубували при 37°С протягом 40-60 хв. (процедура проводилась у вологій камері). На відмиті у ЗФР скельця наносили суспензію клітин у концентрації 2-4х106 млн/мл. Після 20 хвилинної інкубації при 37°С, препарати переносили до холодильника (4°С), де проводили інкубацію ще протягом 20 хв. Далі скельця промивали у склянці з ЗФР, після чого наносили по 10 мкл МКАТ, проводили інкубацію при 4°С протягом 30 хв і знову промивали у 2-х склянках з ЗФР. Наступним етапом - 30-хвилинна інкубація при 4°С з FІТС-кон'югованими антитілами кролів до імуноглобулінів мишей (Sigma, USA). З промитих та висушених скелець знімали Раrafilm М і наносили суміш гліцерину і параформальдегіду у співвідношенні 1:1. Препарати накривали покровними скельцями, краї запаювали парафіном.
При ідентифікації внутрішньоклітинного антигену проліферуючих клітин (для проникнення МКАТ до ядер клітин) клітини фіксували протягом 5 хв 3,7% розчином параформальдегіду (Sigma, USA), а потім обробляли клітини 0,2% розчином тритона X-100 (Sigma, USA) також на протязі 5 хв. Далі дослідження проводили як і у випадку виявлення поверхневих антигенів.
Облік результатів проводили використовуючи імерсійну флуоресцентну систему мікроскопу ЛЮМАМ-1 об.90, ок.5 з системою освітлення, яка забезпечує світло з довжиною хвилі 495 нм, при якому спостерігається максимальна флуоресценція мітки в місцях зв'язування антигена з антитілом. Система, прийнята для спостереження флуоресценції, дозволяє спостерігати флуоресценцію, а також препарати в проходячому світлі за допомогою фазово-контрасної оптики. Таким чином реалізується можливість одночасного врахування клітин препарату, які зв'язали флуоресцентну мітку (число клітин, які прореагували зі специфічними МКАТ) і клітин, що не зв'язали флуоресцентну мітку (загальне число клітин). В кожному препараті вели підрахунок не менше 200 клітин. Процент досліджуваних клітин, які зв'язали МКАТ, вираховували виходячи з розрахунку, що загальна кількість підрахованих клітин складає 100%, а число клітин з флуоресцентною міткою складає процент, який визначався.
2.2.3. Визначення проліферативної активності лімфоцитів периферичної крові. Проліферативну активність лімфоцитів вивчали на підставі їх здатності трансформуватись в бласти. Для стимуляції лімфоцитів використовували мітоген фітогемаглютинін (Difco, USA) в дозі 8 мкг/мл. В пробірки з 2 мл стерильного середовища RPMI з доданими антибіотиками та 15% ембріональної теляч