РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота виконана на кафедрі епізоотології та організації ветеринарної медицини Національного університету біоресурсів і природокористування України, у Волинській обласній державній лабораторії ветеринарної медицини, на Державній Сумській біологічній фабриці, у ряді господарств неблагополучних щодо емфізематозного карбункулу великої рогатої худоби Волинської, Івано-Франківської та Рівненської областей. Основні дослідження проведені в період з 1994 по 2007 роки.
Об'єкти дослідження: епізоотична ситуація, інфекційний та епізоотичний процеси, етіологія, діагностика і профілактика емфізематозного карбункулу великої рогатої худоби, біологічні та імуногенні властивості Сl. chauvoei.
Предмет досліджень:
- велика рогата худоба (7182 голови), вівці (15 голів), морські свинки (614 голів), кролі породи шиншила (13 голів), білі миші (340 голів);
- штами мікроорганізмів роду: Clostridium - Сl. chauvoei (музейні штами - 11, польові - 19, виробничі - 1), Cl. septicum (2 штами), Cl. perfringens (2 штами), Cl. oedematiens (2 штами), Cl. botulinum (2 штами), Cl. tetani (2 штами), Cl. histolyticum (2 штами), Cl. sporogenes (2 штами); Bacillus - B. anthracіs (вакцинний штам 55), B. cereus, B. mycoides, B.mesentericus (всі музейні штами);
- проби ґрунту із худобомогильників, території ферм, приміщень та лучних пасовищ неблагополучних і благополучних щодо емфізематозного карбункула пунктів - всього 213 проб;
- дані ветеринарної статистики МЕБ, Державного комітету ветеринарної медицини, обласних управлінь та державних лабораторій ветеринарної медицини України.
Методи дослідження: В роботі використано такі методи досліджень: епізоотологічний [28, 125, 126, 154, 155], історико-статистичний [422], порівняльно-географічний [26, 328], епізоотологічного обстеження [239, 260, 367, 428], клінічний [258], патоморфологічний [368], імунологічні [6, 101, 184, 170, 504]; бактеріологічний [12, 266, 280], гематологічні [250, 257], токсикологічні (летальний токсин - за M.S. Jayaraman et al. [594]; гемолізин - за S. Ramachandran [678]; ДНК-азу - за I.J.I. Princewill, C.L. Oakley [670]; гіалуронідазу - за В.М. Никитиным [317] і I.J.I. Princewill, C.L. Oakley [671]; лізоцим - методом агарових пластинок [291]); біохімічні [42, 43], статистичні [254, 389, 422]. Економічні розрахунки визначали за И.Н. Никитиным, М.Г.Нигматулиным [318].
Епізоотологічний моніторинг емфізематозного карбункулу проводили у два етапи:
- на першому етапі збирали даних про розповсюдження інфекції в різних країнах світу і в Україні;
- на другому етапі вивчали закономірності просторово - часового розповсюдження емкару на різних континентах, а також в Україні в розрізі 25 адміністративних регіонів і в окремих господарствах.
Вивчення епізоотологічних особливостей емфізематозного карбункулу проводили в межах природно-географічних територій та окремих господарств.
В умовах експерименту вивчали особливості взаємин в ланцюгу: паразит - господар, вірулентні, імуногенні та протективні властивості збудника емфізематозного карбункулу, а також конструювання живильного середовища та вакцинних препаратів.
Теорію епізоотичного процесу та системи управління ним формували на підставі даних епізоотологічних, мікробіологічних і біологічних досліджень.
Діагноз на емфізематозний карбункул ставили на підставі тестів, регламентованих "Інструкцією про заходи проти емфізематозного карбункулу" [172]. Бактеріологічні дослідження проводили за методиками [290] та описаними Н.И. Розановым [381]; В.М. Львовим [266], В.Я. Антоновым [415]. Мазки-відбитки фіксували на полум'ї і фарбували за Грамом, а згодом за модифікованим методом фарбування мікробів, запропонованим ІЕМ ім. Ф. Гамалеї. Морфологічні та тинкторіальні властивості клостридій визначали під мікроскопом марки "Біолар" (Польща) при збільшенні 700 раз. Для вивчення властивостей нативних культур клостридій (рухливість, спороутворення, морфологія) використовували фазово-контрастну мікроскопію. Культуральні та біохімічні властивості Cl. chauvoei вивчали за загальноприйнятими методиками, що застосовуються в державних лабораторіях ветеринарної медицини [280] на традиційних живильних середовищах (середовище Кітт-Тароцці, м'ясо-пептонно-печінковий бульйон, кров'яний та сироватковий глюкозний МПА, мозкове середовище, середовище Вільсон-Блєра, піврідкий агар з цукрами), токсигенні властивості - на середовищі за прописом M.S. Jayaraman et al. [594], а згодом - на розробленому нами середовищі токсинонакопичення (Деклараційний патент № 60761 А). На останньому вивчали біологічні властивості токсину Cl. chauvoei, його антигенну й імуногенну здатність. Для вивчення біологічної характеристики токсину використовували надосадову рідину 24-годинних культур, інкубованих при 37? С. Центрифугування культур для отримання надосадової рідини проводили на охолоджувальній центрифузі Т-23 при температурі 4-5?С, при 4000 об/хв. протягом 15 хв.
Гемолітичні властивості ізолятів Cl. chauvoei визначали за методикою S. Ramachandran [678]. Як робочу використовували 1%-ву суспензію 4-разово відмитих 0,85%-им розчином NaCl еритроцитів барана. Суспензію еритроцитів зберігали при 4-6?С не довше 48 год. Реакцію гемолізу проводили у пластикових планшетах в об'ємі 1 см3 (0,5 см3 робочої суспензії еритроцитів і 0,5 см3 відповідного розведення надосадової рідини). Як розчинник використовували 0,85%-ий розчин NaCl, забуферений фосфатним буфером з рН 6,8. Робили 2-кратні розведення. Планшети інкубували в умовах вологої камери при 37? С протягом 2 год. і проводили облік реакції за ступенем гемолізу. Гемолітичну активність виражали у гемолітичних одиницях (го), які розраховували за такою методикою: останнє розведення надосадової рідини, яке викликало повний гемоліз еритроцитів, приймали за кількість гемолітичних одиниць; наприклад, якщо було розведення 1/64, то це означає, що надосадова рідина містить 64 го/см3.
Визначення дезоксирибунуклеазної активност
- Київ+380960830922