РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота була проведена на 170 білих щурах, самцях масою 200?25 г. Тварин згідно до поставлених задач було розподілено на чотири групи:
I. Тваринам першої групи проводили перетин лівого сідничого нерва на межі верхньої та середньої третини стегна з подальшою нейрорафією;
II. Тваринам другої групи також проводили перетин лівого сідничого нерва на межі верхньої та середньої третини стегна з подальшою нейрорафією і трансплантацією ембріональної нервової тканини в зону шва субепіневрально з двох сторін;
III. Тваринам третьої групи проводили перетин лівого сідничого нерва на межі верхньої та середньої третини стегна, а потім на межі нижньої і середньої третини стегна на віддалі 5 мм від першого розрізу з подальшою аутотрансплантацією.
IV. Тваринам четвертої групи також проводили перетин лівого сідничого нерва на межі верхньої та середньої третини стегна з резекцією нерва у середній третині стегна та подальшою алотрансплантацією сідничим нервом (довжина алотрансплантату 5 мм).
Кількість тварин в кожній з груп була однаковою і становила 40 щурів.
Крім того, для імуноморфологічних досліджень було використано ще 10 інтактних тварин з метою контролю, як імунологічних показників, так і електронно-мікроскопічних показників.
2.1. Методика проведення оперативного втручання та підготовки матеріалу для трансплантації
В якості ввідного використовували інгаляційний наркоз фторотаном. Оперативне втручання у подальшому виконували в стерильних умовах під перитонеальним наркозом сумішшю каліпсолу та реланіуму на 0,9% розчині хлориду натрію в дозі 5мг/100г і 1мг/100г відповідно. Доступ виконувався в середній-верхній третині стегна за проекційною лінією сідничого нерва. Після обробки операційного поля розтиналися м'які тканини, а потім тупо за допомогою затискача типу "москіт" виділяли сідничий нерв. Нерв пересікався лезом безпечної бритви в вищезгаданій ділянці в середній третині стегна на відстані 20?1,5 мм (вимірювалася за допомогою лінійки) від точки виходу сідничого нерва з порожнини малого тазу. Для ауто-та алотрансплантації гострим лезом виконували перетин нерва у двох місцях: на межі верхньої та середньої третини стегна, а потім на межі нижньої та середньої третини стегна на віддалі 5 мм від першого розрізу. Для алотрансплантації ? з подальшою резекцією нерва в середній третині стегна з наступною аутопластикою сідничим нервом довжиною 5 мм. Потім накладали епіпериневральні шви у кількості 3-4 на нерв (для ауто- і алотрансплантації ? у двох місцях) атравматичною голкою з монофіламентною поліамідною ниткою 10/0 фірми Ethicon(r). Операцію проводили з використанням операційного мікроскопа при збільшенні ?12.
Для трансплантації використовували тканину спинного мозку 7-8-добових щурячих ембріонів, отриманих шляхом кесарського розтину вагітної самки, який проводили в стерильних умовах під перитонеальним наркозом сумішшю каліпсолу та реланіуму на 0,9% розчині хлориду натрію (дози препаратів становили 5 мг / 100 г і 1 мг / 100 г відповідно). Виділення спинного мозку виконували в стерильних умовах під мікроскопом (збільшення в 32 рази) з використанням мікрохірургічного інструментарію. Після виділення спинний мозок ретельно звільняли від оболонок, розрізали на фрагменти розмірами приблизно 0,25-0,3 мм3, відмивали в ізотонічному розчині хлориду натрію і розміщували в стерильних чашках Петрі, заповнених середовищем № 199 в термостаті при температурі 37,50С. Об'єм трансплантатів становив приблизно 0,25±0,05 мм3 в кожному випадку і вимірювався по об'єму витисненої рідини шляхом занурення трансплантата в градуйовану пробірку з 0,9% розчином хлориду натрію.
Введення трансплантатів виконували за допомогою пристрою, що складався з градуйованої мікроподачі, мікрогвинт якої був жорстко зчеплений з поршнем мікрошприца Гамільтона. До шприца була приєднана силіконова трубочка, кінець якої з'єднувався зі скляною канюлею L-подібної конфігурації, що потоншувалася в дистальному напрямку. Всю систему заповнювали поживним середовищем № 199. За допомогою мікрогвинта шматочок ембріональної нервової тканини об'ємом приблизно 0,25-0,3 мм3 засмоктувався в кінчик скляної канюлі і поступовим зворотнім обертанням мікрогвинта "вичавлювався" в зону шва нерва під епіневрій. Кількість трансплантатів становила 1-2 шматочки, в залежності від розміру, а загальний об'єм трансплантації становив 0,5±0,1 мм3.
Після проведення гемостазу рану ретельно зашивали. Після операційного втручання контрольні і дослідні тварини отримували однакове харчування згідно норм віварію.
Контроль за регенерацією виконували на 5, 15 та 30 добу після операції. Для контролю використовували електронну мікроскопію, електронейроміографію та імунологічні дослідження.
Розподіл лабораторних тварин за групами залежно від термінів та методів дослідження представлено у таблиці (табл.2.1).
2.2. Методика проведення морфологічних досліджень
З метою забору матеріалу для проведення гістологічного дослідження нерв було умовно поділено на три ділянки (кожна довжиною приблизно 5 мм):
I. зона шва нерва
II. проксимальний відділ
III. дистальний відділ.
Для електронно-мiкроскопiчного дослiдження фрагменти тканини сідничого нерва (проксимальний відділ, зона шва, дистальний відділ) експериментальних тварин розміром 1,5 мм3 забиралися відразу після декапітації тварин. Загалом в І і ІІ групах дослідження було забрано по 45 фрагментів для електронної мікроскопії (5 тварин: проксимальний відділ, зона шва, дистальний відділ); в ІІІ і ІV групах ? по 75 фрагментів для електронної мікроскопії (5 тварини: проксимальний відділ, зона першого шва, зона ауто- або алотрансплантата, зона другого шва, дистальний відділ).
Табл. 2.1 Розподіл лабораторних тварин за терміном дослідження
Експеримента-льні групиТермін дослідженняВсього5 діб15 діб30 дібМікрохірургічний шов нерва10151540Мікрохірургічнийшов нерва + ТЕНТ10151540Аутотранс