ГЛАВА 2.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи дослідження
Було обстежено 100 хворих на гіпертонічну хворобу, які проходили курс стаціонарного лікування в умовах терапевтичних відділень ТМО Червонозаводського району. Серед хворих було 55 жінок (55%) та 45 чоловіків (45%) в віці від 40 до 65 років (середній вік склав 54.10?7.50 років). Групу порівняння склали 20 практично здорових осіб у віці від 35 до 48 років (середній вік - 42.34?4.50 років).
Протягом 3-5 днів усі обстежені проходили комплексне клінічне обстеження, яке включало лабораторні (клінічний аналіз крові, клінічній аналіз сечі, визначення рівній сечовини, креатиніну, цукру, холестерину, загальних ліпідів, ?-ліпопротеїдів, натрію та калію у плазмі крові) та інструментальні (електрокардіографія, рентгеноскопія органів грудної порожнини, ехокардіографія, ультразвукове обстеження органів черевної порожнини) дослідження. Також хворі були консультовані невропатологом, офтальмологом та ендокринологом. Скарги, дані анамнезу та об?єктивного статусу, дані лабораторно-інструментальних досліджень дозволили виключити симптоматичний характер артеріальної гіпертензії та встановити стадію захворювання з урахуванням пошкодження органів-мішеней. З програми тематичного дослідження були виключені хворі, які мали значну супутню патологію.
У всіх хворих та осіб контрольної групи проводилось визначення рівня норадреналіну та адреналіну в плазмі крові. Для цього натщесерце в умовах спокою та положенні лежачи з локтевої вени забирали кров в кількості 5 мл у центрифужні пробірки, куди передчасно додавали 0.5 мл 4% розчину ЕДТА [256]. Пробу зразу ж охолоджували в крижаній воді. Плазму відділяли центрифугуванням протягом 15 хвилин з швидкістю 1500-2000 обертів/хвилину. Центрифугування проводилось не пізніше 30 хвилин з моменту взяття проби. Після забору 1 мл плазми у силіконовані пробірки її в той же час заморожували при температурі -20 0С (95). В подальшому здійснювали виділення біологічно активних речовин шляхом адсорбції та елюції на хроматографічних колонках з використанням карбоксиметілцелюлози ("Renal", Угорщина) з послідовною обробкою отриманої субстанції буфером 1, до складу якого надходив 0.01 М фосфатний буфер (рН 6.2), та буфером 2, який складався з 0.03М фосфатного буфера (рН 6.2). В результаті цього отримували фракцію, яка складалась з норадреналіну, адреналіну, дофаміну, серотоніну та інших речовин. Для виділення норадреналіну та адреналіну проводили окислення цієї фракції за методом Осінської В.О. (1957), наслідком чого було отримання флюоресціюючих продуктів їх окислення. Вимір інтенсивності флюоресценції здійснювали за допомогою спектрофлюориметра MPF-4 "Hitachi" (Японія). Диференціювання норадреналіну та адреналіну проводили за допомогою двох інтерференційних світофільтрів: первинний - з максимумом пропускання 399 та 445 нм, вторинний - з максимумом пропускання 510 нм. При цьому інтенсивність флюоресценції адреналіну була однакова при 399 та 445 нм, в той час як для норадреналіну вона була у 2.5 рази більше при фільтрі 399 нм.
В якості стандартів використовували Sol. Adrenalini hydrotartratis 0.18%-1 ml та Sol.Noradrenalini hydrocloridi 0.2%-1 ml, обробку яких проводили точно також, як і експериментальних зразків.
Розрахунок вмісту адреналіну проводили за формулою:
Адреналін = n х 4.5 х 1000 (мкг/л) (2.1)
47 1000
де n - показник приладу для експериментального зразка; 4.5 - навіска стандарту, мкг; 47 - показник флюоресценції вищевказаної навіски стандарту при довжині хвилі 445 нм; 1000 - коефіцієнт, необхідний для переходу від мілілітрів до літрів; 1000 - коефіцієнт, необхідний при переході від одних приладних одиниць до інших.
Розрахунок вмісту норадреналіну проводили за формулою:
Норадреналін = n х 5 х 1000 (мкг/л) (2.2)
39 1000
де n - показник приладу для експериментального зразка; 5 - навіска стандарту, мкг; 39 - показник флюоресценції вищевказаної навіски стандарту при довжині хвилі 399 нм; 1000 - коефіцієнт, необхідний для переходу від мілілітрів до літрів; 1000 - коефіцієнт, необхідний при переході від одних приборних одиниць до інших.
Рівень фактора некрозу пухлин - ? (ФНП-?) визначали за допомогою набору ProCon TNF? (Росія), де використовувався твердофазний імуноферментний метод з використанням пероксидази хрону в якості індикаторного ферменту. Аналіз проводився з використанням нерозбавлених зразків плазми крові людини. Зразки заморожувалися та зберігалися при температурі не вище - 20 0С.
Вміст цАМФ та цГМФ вимірювали за допомогою імуноферментних наборів АТ "Біоімуноген" (Росія). Принцип застосованого метода базується на конкуренції між адсорбованим на поверхні лунок планшета циклічного нуклеотіда та вільним (в калібровочній пробі або аналізуємому зразку) циклічним нуклеотідом за активні центри зв?язування афінних антитіл до циклічного нуклеотіда, мічених біотином. Після внесення кон?югату стрептавідін-пероксидаза кількість зв?язаних антитіл вимірюється за допомогою субстрат-хромогенонї суміші. Інтенсивність кольору хромогену зворотно пропорційна вмісту циклічного нуклеотіда в аналізуємому зразку.
Функціональну активність адренорецепторного комплексу оцінювали за допомогою метода НВЧ-діелектрометрії, який є унікальним для вивчення молекулярних механізмів трансмембранної передачі сигналу в клітину в умовах неруйнуючого контролю при моделюванні його шляхів розповсюдження за допомогою біологічно активних речовин. Вивчення діелектричних характеристик дозволяє оцінювати стан водного компоненту біосистеми. Фізичною основою цього явища є різниця діелектричної проникливості біополімерів та зв?язаної води в порівнянні з діелектричною проникливістю вільної води, тому що в даному діапазоні знаходиться область дисперсії вільної води. За допомогою цього метода можна аналізувати конформаційні перетворення біополімерів водної системи та водних компонентів під впливом
- Київ+380960830922